通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

使用不同生物墨水的能力对于成功开发生物打印结构至关重要，而该技术能够实现通常与传统打印技术不相容的材料的应用。支撑介质可在低黏度生物墨水沉积时防止其塌陷，并允许在单一结构中整合不同的生物墨水，从而形成更接近天然组织的化学和机械特性区域差异。本次操作演示由伯明翰大学的研究员 Tom Robertson 博士和哈德斯菲尔德大学的研究员 Jessica Senior 博士完成。

首先，打开流变仪并安装40毫米带齿几何夹具，预热30分钟。使用零间隙高度功能将流变仪的间隙高度归零。在下部平板上加入约2毫升样品，然后降低上部夹具，使间隙高度为1毫米。

使用平整且无研磨性的边缘刮除板间挤出的多余材料，将多余液体从间隙处刮走，并用纸巾吸干。为测定生物墨水的可注射性，从用户选项中选择“黏度测试”进行流变分析。设置剪切速率控制的斜坡测试参数，剪切速率范围为0.1至500每秒，斜坡时间为1分钟。

加载新样品并重复该过程以确保可重复性。为确定生物墨水的凝胶特性，从用户选项中选择振荡测试进行小形变测试。在恒定应变条件下设置单频率测试参数：频率为1赫兹，应变为0.5%，持续时间为一小时，同时墨水发生凝胶化。

使用之前步骤中通过剪切速率控制的斜率测试确定的上限和下限应力，在新样品上重复进行应力控制模式下的流变仪斜率测试。为了对凝胶化样品进行原位振幅和频率测量，请从用户选项中选择振荡测试。在选择振幅扫描后，设置振幅扫描测试的参数：在保持频率恒定为1赫兹的条件下，进行应变控制范围为0.01%至500%的测试。

完成测试后，分析谱图以确定线性黏弹性区域。在流变仪上加载新样品并使其凝胶化，然后从用户选项中选择振荡测试。

选择频率扫描测试，并在 0.01 至 10 赫兹范围内输入频率参数，同时选择在之前振幅扫描数据所确定的线性黏弹性区域内的应变值。为了启动 CAD 软件并开始生成 CAD 模型，请选择软件中的“工具”选项，然后点击“材料”以定义所选生物墨水的打印参数。在“厚度”选项卡中输入估计的丝状直径，以确定每一层的 z 方向厚度。

要逐层设计结构，请使用软件中的“图层”选项卡，通过“组合”选项卡对图层进行分组，并使用“层级”选项卡将每个图层分配到 z 平面上的特定层级。通过创建一个沿 x 轴方向具有丝状结构的图层和另一个沿 y 轴方向的图层，并将这两个图层分配到独立的层级，从而生成晶格结构。在“组合”选项卡下，通过选择结构中重复单元的数量来确定构建高度。

然后点击生成工具，为设计创建 G 代码并查看结构的 3D 渲染图。在生物打印机中，将生物墨水分装至打印 cartridge 中，并将其旋紧到微阀上方的打印头中。然后点击针头长度测量功能，以校准打印头。

接下来，将组装好的打印头连接至气动压力系统，并将培养容器装载到打印平台上。选择适当的压力后，打开先前生成的G代码，点击“运行”以启动打印过程。颈动脉打印完成后，使用注射器和针头在构建物周围注入2毫升200毫摩尔的二水合氯化钙溶液。

至少三小时后，从构建物周围移除流体凝胶支撑床，并用 PBS 轻轻冲洗。然后使用刮铲将构建物从支撑浴中取出。通过在 30、60 和 120 千帕压力下挤出，观察了海藻酸盐和胶原蛋白晶格的打印分辨率随丝状物直径的变化情况，结果表明，分辨率可随挤出压力的变化而直接调节。

为了实现与皮肤相似的力学性能梯度，在真皮层和皮下层中使用了不同比例的果胶和胶原蛋白，从而形成无分层迹象的结构。在培养14天后，整个结构中均观察到较高的细胞活力，期间材料发生硬化，表明材料发生了重塑。进行流变学测试时，正确加载样品至关重要，以确保数据的可重复性；而在生物打印过程中，结构在从支撑床中取出之前必须完全交联。

长期培养大规模组织构建物有助于探究嵌入细胞对物理和化学刺激的响应。