3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

我们设计了肺组织的三维模型，以帮助世界更轻松地呼吸。我们的使命是利用3D生物材料和3D打印等技术，构建有助于理解慢性肺部疾病成因以及改善这些疾病治疗方法的研究平台。我们研究中的一项实验挑战在于难以将柔软材料3D打印成复杂形状。

我们通过将生物墨水打印到一种剪切稀化支撑浴中，从而精确地沉积细胞，该支撑浴有助于在打印过程中维持细胞的形态。我们的生物材料可在整个实验过程中调控样品的力学性能。该配方使研究人员能够在与健康和病变肺组织刚度相匹配的水凝胶中培养细胞。

用户可自主决定何时对样品进行硬化，并测量细胞的响应。本方案中使用的光可调生物材料能够构建一种初始处于软化状态的模型，随后可通过硬化来研究细胞对微环境硬度增加的响应。相比之下，若采用静态生物材料而非光可调生物材料的类似技术，则所构建的模型在打印完成后无法再进行硬化。

本实验室其他研究的结果表明，性别和年龄在肺部疾病进展中起着关键作用。未来的模型将研究这些变量，并包含更多复杂性，例如增加细胞特异性层次。结合这些努力将产生更逼真的生物打印组织，并为治疗纤维化疾病提供新方法。

在生物安全柜内无菌条件下开始水凝胶生物墨水的制备，首先在不含FBS的无菌细胞培养基中配制浓度为0.25毫克/毫升的PEG alpha甲基丙烯酸酯储备液。同时，使用20毫摩尔的无菌TCEP，分别配制250毫摩尔的DTT MMP2可降解交联剂和RGD肽的储备液。最后，使用蒸馏水配制15%（重量/体积）的PEO储备液。

将所需量的预配置试剂储备液和低血清细胞培养基与成纤维细胞在15毫升锥形管中混合。使用正向置换移液器充分混匀所得的生物墨水，以确保细胞呈单细胞状态。验证最终前体溶液的pH值为6.2。

从生物打印机上取下打印头以接触玻璃注射器。将生物墨装入玻璃注射器时，先移除注射器活塞，然后使用另一支连接1.5英寸长15号钝头针头的注射器从离心管中吸取生物墨。将15号针头更换为30号0.5英寸长钝头针头，并将生物墨转移至玻璃注射器中，注意避免产生气泡。

最后，将玻璃注射器放入打印头中，并安装打印头组件，确保组装牢固以进行打印。开始光可调水凝胶结构的3D打印时，将装有含成纤维细胞水凝胶生物墨水的玻璃注射器放入打印头中，并安装打印头组件，确保组装牢固以进行打印。然后，使用Pronterface软件中的方向箭头，手动并小心地调整挤出针在孔板孔中心支撑浴浆液中的位置。

针尖下方至少保留一毫米的浆料。针尖位置正确后，按下 Pronterface 软件中的打印按钮，等待打印完成。重复前述步骤，直至获得所需数量的生物打印结构。

打印完成后，将含有构建物的孔板在生物安全柜中室温下静置一小时，并保持覆盖状态。此步骤可使光可调水凝胶生物墨水发生碱催化聚合反应。随后，将含有3D生物打印构建物的孔板置于37摄氏度的无菌培养箱中孵育12至18小时，以融化支撑浴浆料。

接下来，在生物安全柜内更换生物打印结构周围的培养基。操作时，手动移除孔中培养基及融化的明胶支撑浴液，注意不要扰动结构。然后向每孔中加入适量的低血清培养基。

同样，在预期的硬化时间点前 24 小时，将孔中的培养基更换为添加了 2.2 毫摩尔无菌 LAP 的低血清培养基。在预期的硬化时间点，移除需要硬化的孔中一半的培养基，并将无盖的培养板置于 OmniCure 的紫外线（UV）灯下。打开带有 365 纳米带通滤光片的紫外灯，对构建物照射 5 分钟以完成硬化。

硬化后，在向各孔中加入新鲜的低血清培养基之前，移除这些孔中剩余的培养基。将培养板放回培养箱中，直至在预定时间点进行成纤维细胞活化实验。酸性生物墨水与碱性支撑浴浆料的结合促进了3D生物打印结构的聚合，并维持了圆柱形结构。

荧光标记水凝胶的显微观察显示，水凝胶内部存在由明胶微粒在支撑浴中诱导形成的孔隙。共聚焦显微镜显示了在三维空间中对硬化区域的精确控制。成纤维细胞活力检测结果表明，在各个时间点，壁厚为300微米且每毫升含有400万细胞的构建物表现优于所有其他条件。

细胞活力在第7天达到峰值，约91%的细胞呈活细胞染色；到第14天时，仍有85%的细胞保持活性。