利用荧光原位杂交技术探索卵巢细胞中的X染色体异常

对患有X染色体异常的女性的卵巢细胞进行FISH分析，是一种独特的技术，可用于深入了解该特定群体卵巢细胞中的X染色体含量。这些技术有助于进一步研究X染色体异常女性的生殖潜力。需要强调的是，这两种方法旨在促进未来的研究，而非设计用于临床实践中的诊断工具。

演示该操作的将是来自我们生育实验室的高级研究员 Ronald Peek，以及来自病理科的分析师 Milad Intezar。首先，使用手术刀将冷冻保存或已解冻的卵巢皮质组织切成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的小块。将组织碎片置于 4 L 预热的 L15 培养基中，在 37°C 下酶解消化 75 分钟。

每15分钟用移液器将消化混合物上下吹打一次。加入4毫升含10%胎牛血清（FBS）的冷L15培养基终止酶消化反应。用8毫升冷L15培养基将离散组织在500 g条件下离心洗涤一次，随后重悬于500微升L15培养基中。

将含有大量单个基质细胞和小卵泡的细胞悬液转移至塑料培养皿中，在体视显微镜下观察悬液。使用75微米的塑料移液管手动挑选直径小于50微米的卵泡，并将其转移至含有10%胎牛血清（FBS）的L15培养基液滴中，置于4摄氏度环境中。随后将纯化的卵泡转移至含有0.06%胰蛋白酶、1毫克/毫升EDTA和1毫克/毫升葡萄糖的溶液中，在37摄氏度条件下孵育20分钟。

孵育后，使用75微米的塑料移液管从皮质细胞悬液中获取卵巢间质细胞。对于单个卵巢细胞的荧光原位杂交（FISH）分析，将经胰蛋白酶/EDTA/葡萄糖处理的卵巢卵泡或间质细胞转移至载玻片上含有5微升0.15毫摩尔氯化钾和15微升DPBS的液滴中，在37摄氏度下孵育20分钟。随后在载玻片上用300微升含0.05毫摩尔氯化钾、7.5%乙酸和22.5%甲醇的溶液干燥并预固定2分钟。

用三比一的甲醇-乙酸溶液覆盖玻片，持续两分钟以完成固定。固定后，在73摄氏度的 freshly prepared SSC 溶液中洗涤样本两次。加入100 µL的2%蛋白酶K，并用盖玻片密封。

将载玻片置于杂交仪中，在 37 摄氏度孵育 10 分钟。孵育结束后，移除盖玻片，并在室温下于 DPBS 中振荡洗涤 5 分钟。用 1% 多聚甲醛固定样品 5 分钟。

然后用DPBS清洗载玻片，并依次用浓度递增的乙醇进行脱水处理，每次两分钟。样本空气干燥后，再与荧光标记的探针进行杂交。接着，向样本中加入1 µL CEPX探针、1 µL CEP18探针以及18 µL杂交缓冲液，然后加盖盖玻片并用胶水将盖玻片固定在载玻片上以密封样本。

将载玻片转移至杂交仪中，在73摄氏度下变性三分钟，随后在37摄氏度下过夜孵育进行杂交。杂交完成后，从载玻片上移除盖玻片及任何残留的胶状物。在72摄氏度下用0.4X SSC、0.3% Tween-20溶液洗涤载玻片两分钟，随后在2X SSC、0.1% Tween-20溶液中孵育一分钟。

按照所示方法将玻片脱水，并在避光条件下空气干燥，然后用含DAPI的封片剂封片。将玻片置于-20摄氏度环境中10分钟，随后进行荧光显微镜分析。如需对石蜡切片进行杂交，应从石蜡带中选择含有卵泡的切片之前或之后的新切片。

取一个组织切片置于载玻片上，在56摄氏度的烘箱中干燥45分钟。用二甲苯脱蜡10分钟，然后将载玻片浸入99.5%乙醇中，并用自来水冲洗5分钟。用靶修复溶液在96摄氏度下对载玻片进行预处理10分钟。

冷却后，用蒸馏水冲洗载玻片。用 0.01 摩尔的盐酸处理载玻片 5 分钟，随后在 37 摄氏度下进行胃蛋白酶消化 15 分钟。再次用盐酸冲洗载玻片，然后用 PBS 冲洗。

将玻片在1%多聚甲醛PBS溶液中固定5分钟。随后用PBS短暂漂洗玻片，再用去离子水漂洗一次，然后在99.5%乙醇中脱水。在预处理好的玻片上加入5微升CEP18和CEPX探针。

然后加盖盖玻片，并用照片胶密封区域。将玻片放入杂交仪中，在80摄氏度下变性10分钟，随后在37摄氏度下过夜杂交。次日，在42摄氏度下用SSC溶液漂洗玻片两次，每次5分钟，接着在73摄氏度下分别用0.3% Nonidet P-40 溶液漂洗2分钟和1分钟。

再次将玻片在2X SSC中冲洗，然后用蒸馏水冲洗，再用99.5%乙醇脱水。将玻片自然晾干，并用含DAPI的封片剂封片。患者A的冷冻保存卵巢皮质组织中，50%的淋巴细胞核型为45, X，50%为46, XX。患者B中，38%的淋巴细胞核型为45, X，28%为46, XX，34%为47, XXX。

还对周围的基质细胞进行了X染色体含量分析。卵巢皮质组织经酶消化后，得到主要为解离状态的细胞悬液，但保留了原始卵泡结构，即由单层颗粒细胞包围的完整卵母细胞。由于颗粒细胞易发生聚集，小卵泡在FISH检测后信号解读较为困难。

在进行FISH分析之前，用胰蛋白酶对卵泡进行额外消化，导致颗粒细胞在卵泡表面收缩成球形形态。苏木精-伊红染色显示，在异种移植五个月后，卵巢皮质组织中存在形态正常的次级卵泡和窦状卵泡。通过FISH分析确定了这些卵泡颗粒细胞的X染色体含量。

使用Bouin溶液固定移植的卵巢皮质组织后，由于绿色雾状背景，卵泡细胞中的荧光信号变得模糊且大部分被掩盖。相比之下，经甲醛固定的卵巢皮质组织可获得极佳的荧光信号。本方案的主要难点在于卵巢细胞的分离以及组织的酶消化过程。

偏离本方案可能导致在操作过程中大量卵巢细胞丢失，对于卵巢储备功能本已较低的女性尤应避免。进一步进行基因表达谱分析可能有助于深入了解非整倍体卵巢细胞对卵泡发生的影响，从而揭示X染色体异常女性发生早发性卵巢功能不全的机制。