利用单链DNA免疫荧光法量化卵巢癌细胞中的复制应激

本方案提供了一种高效且易于重复的方法，用于定量单链DNA，后者是多种细胞系中复制应激的标志物。此外，该方法操作简便，适用于高通量应用和筛选。特别是，该方法可实现对复制应激的快速定量，而复制应激是多种卵巢癌的显著特征之一。

该方法还适用于多种自动分析软件，可进一步提高效率。目前，单链DNA正被积极地视为针对DNA修复通路的化疗响应的一种生物标志物。因此，该方法在这一情境下具有很高的适用性。

复制应激不仅存在于卵巢癌或BRCA1、BRCA2缺陷型癌症中，因此该方法可广泛应用于其他多种细胞类型或疾病背景。首先，通过将经高压灭菌的直径12毫米的盖玻片和多聚赖氨酸溶液加入50毫升锥形管中，并在摇床中孵育15分钟，制备多聚赖氨酸包被的盖玻片。

在组织培养罩中吸除溶液。加入无菌水清洗盖玻片，然后将装有盖玻片的试管重新置于摇床中振荡五分钟。清洗盖玻片三次后，吸去试管中的水，并将盖玻片铺展于无菌培养皿中。

吸净残留水分，将样品置于超净工作台中晾干一小时，或直至无水滴残留。干燥后，用封口膜密封培养皿，并置于4摄氏度保存。为防止预提取步骤中细胞从盖玻片上脱落，将一片经多聚赖氨酸包被的盖玻片放入24孔板的每个孔中。

当OVCAR3细胞生长至70%至80%融合度时，吸去培养板中的培养基，并用5至7毫升PBS洗涤细胞。吸去PBS。吸净PBS后，加入1毫升0.25%胰蛋白酶，将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育8至10分钟，或直至细胞从培养板底部脱落。

用5到10毫升培养基收集细胞，并将细胞悬液加入锥形管中。按照标准操作流程，使用血细胞计数板手动计数细胞。接着，稀释细胞悬液，调整细胞数量，使其经过三次传代后达到70%至80%的融合度。

将1毫升细胞悬液加入置于24孔板孔中的多聚赖氨酸盖玻片上，在标准条件下于培养基中培养细胞。经过一个群体倍增后，吸去孔板中的原有培养基，并在接下来的两个群体倍增期间用10 µM IdU对细胞进行脉冲处理。收集细胞时，将培养基替换为预冷的含0.5% PBSTx的溶液，冰上作用5分钟。

细胞固定时，吸去 PBSTx，于室温下用 3% 多聚甲醛孵育细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤三至四次后，将固定后的细胞置于 4 摄氏度保存，以备后续使用。固定完成后，在冰上用 0.5% PBSTx 对细胞进行透化处理，持续 5 分钟，确保完全覆盖整个盖玻片。

在室温下用1毫升0.2% PBST洗涤细胞三至四次后，吸去PBST，并用PBS配制的5% BSA在室温下封闭样本30分钟。进行免疫染色时，通过在平底塑料盒底部放置湿润的纸巾来制备统一的孵育环境。用Parafilm封住24孔板的盖子。

将其放入湿化孵育盒中，并将盖玻片平铺在培养板盖上。在盖玻片表面加入60微升稀释的抗BrdU小鼠一抗。或者，为减少抗体干燥并节省用量，可在Parafilm膜上滴加一滴稀释后的抗体，然后将盖玻片倒置贴附于液滴上。

然后在37摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，吸除一抗。将盖玻片放回24孔板中，并用0.2% PBST洗涤四次。

按照之前的方法在盖玻片上加入稀释的二抗，室温避光孵育一小时。标记载玻片，并用含DAPI的封片剂将盖玻片封于载玻片上。若封片剂需要固化或硬化，则将载玻片置于室温避光处保存24小时。

未经处理和经0.5毫摩尔羟基脲处理的细胞来源的细胞核在DAPI和IdU通道中被染色并可识别。对这些图像的分析包括量化每个细胞核中的焦点数量。焦点数量与复制应激程度成正比。

在选择细胞系时，必须考虑其倍增时间，因为IdU脉冲标记的时间可能需要根据倍增时间的长短进行调整。此外，我们可以通过检测细胞中复制蛋白A来验证实验结果，并评估细胞内多种复制应激反应。该技术可与多种细胞系联合使用，并可结合任何诱导DNA损伤的试剂，用于检测单链DNA的积累情况。

因此，该方法具有广泛的可及性和适用性。