胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

本研究所展示的胰腺组织解离方案操作简便，可作为一种有效工具，用于从恶性病变过程不同阶段（包括实体瘤）的胰腺组织中分离出具有活性的单细胞。获取完整且具有活性的腺泡细胞是一项主要挑战。该方案能够从正常胰腺、存在癌前病变的胰腺以及含有大量间质细胞和免疫细胞的胰腺肿瘤中成功回收具有活性的单细胞。

采用本方案分离人类胰腺肿瘤或炎症胰腺组织，有助于深入研究这些疾病，以发现新的生物标志物和治疗方法。该方法操作简便，经过少量练习即可获得理想结果。本视频将有助于观察该方案中的细微操作步骤。

开始解剖前，将所有器械和设备预先置于冰上备用。固定安乐死小鼠后，用70%乙醇喷洒其腹部。使用剪刀和镊子，在动物的生殖区域做一长约2.5厘米的V形切口，并向上延伸，完全打开腹腔。

在小鼠左侧找到胃，以及靠近脾脏的胰腺。使用两把镊子，小心分离胰腺与胃及十二指肠，避免撕裂。继续操作，将胰腺从小肠、空肠和回肠上分离下来。

将胰腺移至右侧，用镊子分离胰腺与胸腔之间剩余的连接组织，以完全游离胰腺及其附着的脾脏。小心地去除胰腺上的肠系膜脂肪及其他邻近组织，并将胰腺在冰上的培养皿中铺展开以供检查。根据文中所述成分，预先配制解离缓冲液1和缓冲液2、洗涤缓冲液以及酶活性终止液。

将胰腺置于一个50毫升的离心管中，冰上操作，并用含10%胎牛血清（FBS）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冲洗。脂肪会漂浮，而胰腺会下沉。这是一种简便的方法，可直观地识别并快速去除仍附着在胰腺上的白色脂肪组织污染物。

接下来，将小鼠胰腺组织转移至含有5 mL HBSS的无菌培养皿中，置于冰上保存直至切割。使用Noyes剪刀和手术刀将胰腺切成1至3 mm³的小块。将组织转移至离心管后，在4°C条件下以350 × g离心5分钟。

吸弃上清液，以去除细胞碎片和血细胞。将组织块重悬于含有0.02%胰蛋白酶-C和0.05%EDTA的解离缓冲液1中，于37摄氏度振荡孵育10分钟。立即用10%胎牛血清和杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤，并在350×g、4摄氏度条件下离心5分钟。

再次将沉淀重悬于10毫升洗涤缓冲液中，洗涤一次，然后以相同条件离心5分钟，再进行下一步解离。将胰腺组织置于解离缓冲液2中，在37摄氏度下以每分钟180转的速度振荡孵育15分钟。15分钟后，使用无菌移液管对胰腺碎片进行剧烈吹打10次，以实现机械解离。

使用体积逐渐减小的移液器重复操作，依次使用 25、10 至 5 毫升的移液器。将样品孵育至 37 摄氏度。利用光学显微镜根据悬液中单细胞的数量监测解离情况。

使用台盼蓝监测细胞活力。继续孵育，并每五分钟取样一次以检查解离情况。孵育至90%的细胞分离为单细胞为止。

当胰腺组织充分解离，表现为胰腺碎片消失且溶液浑浊度增加时，使用酶活性终止液在4°C条件下洗涤两次，每次五分钟，以终止酶促反应。从该步骤开始，将细胞悬液置于冰上保存。将细胞悬液通过70微米尼龙筛网过滤。

较小的尼龙网孔尺寸可能会降低细胞活力。在显微镜下检查细胞活力。计数细胞前，用5至10毫升预冷的缓冲洗涤液重悬并洗涤细胞沉淀。

若观察到多个红细胞，需在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞2分钟。若观察到细胞团块，应按照前述方法再次使用胰蛋白酶处理样本。若细胞活力低于80%，应使用磁性激活细胞分选法（MACS）或MACS去死细胞试剂盒配合MACS MS柱分离活细胞。

分离的胰腺组织呈现红色，这是由于腺泡细胞表达了tdTomato。在解离的早期阶段，游离细胞数量较少，而细胞团块较多。随后，在避免减少活细胞数量的前提下，获得了大量游离的活细胞。

延长孵育时间降低了细胞的存活率。使用荧光激活细胞分选法对 tdTomato 阳性细胞进行估算。温和解离方案支持多种细胞类型的回收，且细胞存活率较高，可进一步对目标细胞类型进行细胞分选。

活细胞与死细胞计数采用血细胞计数板进行。冷冻胰腺切片的荧光图像显示了 tdTomato 阳性的腺泡细胞。单细胞 RNA 测序证实，在所有时间点获取的每份切除组织中，均检测到荧光激活细胞分选所识别的全部细胞类型。

研究了腺泡细胞中羧肽酶1（carboxypeptidase1）或CPA1的表达，表明与其他细胞类型的转录组污染极少。需要注意的是，较长的孵育时间会降低细胞活力，因此必须定期监测样本，并在显微镜下每隔几分钟观察组织解离情况和细胞活力。该细胞分离方案可用于单细胞RNA测序、细胞培养，或作为类器官培养的起始材料。

该技术可用于探索胰腺癌的发展过程，并研究浸润炎症或癌变组织的细胞之间的相互作用。