“细胞表面捕获”工作流程用于无标记定量分析细胞表面蛋白质组

本方案使我们能够检测不同类型细胞或组织的细胞表面存在的抗原，以发现特定于该类型细胞或组织的抗原。本文所介绍的技术能够从全细胞裂解液中富集细胞膜蛋白，最终通过基于质谱的蛋白质组学进行分析。因此，该方案的一个具体应用是将其应用于肿瘤细胞，以寻找仅存在于癌细胞表面而不存在于正常细胞表面的抗原，这些抗原可作为癌症免疫治疗的新靶点。

关于本实验方案，需要注意的一点是，针对您感兴趣的实验优化样本投入量可能至关重要。因此，可能需要经过多次迭代或滴定才能确定最佳条件。本次实验操作将由本实验室的初级专家 Akul Naik 演示。

首先，从负80摄氏度取出冷冻的生物素标记细胞沉淀，在冰上解冻。向沉淀中加入500微升2倍裂解缓冲液，充分混匀，并剧烈涡旋振荡30秒。在冰上对细胞裂解液进行超声处理，然后于4摄氏度、17,200 ×g 离心10分钟，以沉淀残留的细胞碎片。

在裂解液离心的同时，将100微升NeutrAvidin琼脂糖树脂珠加入连接于真空 manifold 的过滤柱中。施加轻微真空，使3毫升洗涤缓冲液1流过树脂珠以洗涤。将过滤柱从真空 manifold 上取下，封闭底部，然后将澄清的细胞裂解液加入含有树脂珠的柱中。

盖上柱子的顶部，在4摄氏度下将裂解液与珠子在端对端旋转仪上孵育120分钟。完成裂解液孵育后，将过滤柱重新放回真空 manifold 上，并施加轻柔的真空。用5毫升洗涤缓冲液1流经珠子以洗涤。

用5毫升洗涤缓冲液2和洗涤缓冲液3重复洗涤步骤。当最后一次洗涤缓冲液完全流经磁珠后，将层析柱从多通道装置上取下。然后向磁珠中加入100微升裂解液，并用移液器将磁珠转移至一个1.7毫升低蛋白结合力的微量离心管中。

短暂离心管子以沉淀磁珠，并移除50微升上清液。接着，将管子置于预热至65摄氏度的金属浴振荡器中，在1000 RPM条件下振荡10分钟。向试剂盒中的消化管内加入210微升重悬液，重悬干燥的胰蛋白酶，通过反复吹吸数次，确保所有干燥的胰蛋白酶完全重悬。

珠子孵育结束后，将其从加热振荡金属块中取出，并向珠子中加入50微升重悬的胰蛋白酶溶液。将离心管置于37摄氏度条件下，以500转/分钟振荡孵育至少90分钟，以消化蛋白质。消化完成后，将含有珠子的溶液转移至离心柱中，并将该柱插入一个1.7毫升低蛋白吸附的微量离心管中。

离心管子，使消化后的肽溶液与珠子分离。接着，加入100微升终止液以终止消化反应，并酸化肽溶液。使用管适配器，将脱盐柱置于1.7毫升低蛋白结合微离心管中。

将整个酸化后的肽溶液加入柱中。以3,800 G离心3分钟，使溶液流经柱体。弃去穿流液，此时肽已结合在柱上。

向柱中加入 200 微升洗涤液 1，于室温下以 3,800 ×g 离心 3 分钟，弃去穿流液。用 200 微升洗涤液 2 重复洗涤步骤。将柱转移至一个新的已标记的 1.7 毫升低蛋白结合微离心管中。

向柱中加入 100 微升洗脱液，在室温下以 3,800 G 离心 3 分钟。此时肽段已从柱上洗脱至管中。将肽段溶液置于真空离心浓缩仪中，过夜干燥。

将干燥的多肽置于零下80摄氏度保存，直至准备进行定量并在质谱仪上分析。采用液相色谱-串联质谱法进行蛋白质组分析，以表征富集的细胞表面蛋白。根据比色法多肽定量检测结果，最终获得的多肽浓度约为630纳克每微升。

使用 MaxQuant 分析质谱数据，并对细胞表面蛋白进行后续数据集分析，共鉴定出 601 种表面蛋白，约占所有鉴定蛋白的 27%。此处展示了代表性蛋白在 Andromeda 评分中的分布图，散点图说明了样本间的相关性，箱线图则描绘了不同运行之间的变异情况。

样本分布图展示了各重复样本的数据质量。需要牢记的最重要事项是每一步骤中肽段的位置。最初，肽段处于溶液中；随后，它们会结合到磁珠上，直至完成消化；之后，肽段会结合在脱盐柱上，直到最终被洗脱下来。

通过该实验流程，可采用多种方法对鉴定出的部分蛋白质进行验证，例如靶向流式细胞术和靶向蛋白质组学。这将提供关于这些蛋白质在样本中表达水平的更详细信息。