低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。该方案的主要优势在于，任何关注细胞外囊泡的研究实验室均可通过保持无菌操作并使用简单且广泛可用的设备来限制内毒素污染。所有首次尝试该技术的研究人员均应使用标注为低内毒素、无热原的新培养基、试剂和塑料器皿作为起始材料。

本实验方案中，请使用无内毒素的试剂、水、培养基、过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）、超低内毒素胎牛血清（FBS）以及超速离心管。首先，将先前培养的 SW480 和 SW620 细胞系的上清液收集至适当标记的 15 毫升离心管中。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，去除细胞碎片。

在不扰动沉淀物的情况下，将上清液收集到一个新的已标记离心管中，在4°C条件下以3,200 × g离心12分钟。小心地将45毫升上清液转移至一支垂直放置的无菌50毫升离心管中，注意避免润湿管壁边缘。用无菌透明封口膜包裹管盖，并将离心管垂直放置于-80°C环境中，用于后续细胞外囊泡的分离。

开始分离操作前，准备0.22微米的一次性注射器滤器、注射器以及含有约90毫升上清液的离心管。用注射器吸取上清液，并将滤器安装到针头连接器上。通过滤器将上清液过滤至50毫升离心管中。

用移液器将七毫升滤液转移至已准备好的超速离心管中，在4摄氏度条件下以100,000 × g离心两小时。使用无菌巴斯德移液管弃去上清液。用带滤芯的长移液枪头将沉淀收集到超速离心管中。

通过加入七毫升过滤过的无内毒素 PBS 洗涤细胞外囊泡。超速离心后，使用无菌巴斯德吸管弃去上清液，并将沉淀重悬于 200 微升无内毒素 PBS 中。将悬液转移至无菌的 1.5 毫升低蛋白结合试验管中。

然后取10 µL悬浮液转移至新的1.5 mL离心管中用于进一步分析。封好管盖，并在-80 °C条件下保存。现在，取1 µL悬浮液加入另一新管中，用过滤后的PBS按1:1000的比例稀释，用于纳米颗粒追踪分析。

进行印迹分析时，首先将20 µg样品与上样缓冲液混合。在70 °C下孵育样品10分钟。然后将20 µg样品加入含有SDS的10%至14%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中，并在150 V电压下用电泳运行缓冲液进行电泳45分钟。

接下来，将凝胶放入含有Towbin缓冲液的转印仪中，在25伏电压下进行一小时的半干转印，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上。用1% BSA封闭液在摇床上孵育一小时以封闭膜。向膜中加入用BSA稀释的一抗（抗CD9或抗Alix抗体），在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。

除去抗体后，用10毫升TBST洗涤膜三次，每次10分钟。随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗小鼠二抗，在室温下于摇床上孵育1小时。弃去抗体溶液，并按照前述方法洗涤膜。

将含有底物和鲁米诺（luminol）且比例相等的溶液一毫升滴加到膜上。立即把膜放入成像系统，在屏幕上观察蛋白条带。本研究中，蛋白质印迹分析证实了两种细胞外囊泡标志物 CD9 和 Alix 的存在。

从SW480和SW620细胞中分离的囊泡的平均大小和浓度相似。用不同剂量的脂多糖（LPS）刺激单核细胞显示，能够诱导单核细胞分泌白细胞介素10和肿瘤坏死因子的最低LPS剂量为每毫升50皮克。显色LAL检测表明，两种细胞系的细胞外囊泡中LPS污染水平均约为每毫升50皮克。

最重要的是使用无内毒素或经去除内毒素的试剂，并在实验流程的每一步常规检测内毒素含量。预防内毒素污染比清除污染更为容易。本方案可最大限度减少因外泌体被内毒素污染而导致的假阳性结果，并能够评估每细胞外泌体的活性。

本方案适用于使用对内毒素敏感细胞（如单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞）进行研究的研究人员。