免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

该方案能够有效保证细胞外囊泡的高质量分离，并检测到更多EBDF蛋白。与其他分离技术相比，该方法能更好地保持细胞外囊泡的完整性及其生物学活性。目前，细胞外囊泡在肺癌以及各种病理条件下的研究日益增多。

该方法可应用于我们选择的任何用于表征和研究细胞外囊泡（EVs）的系统。在处理EVs时，特别是涉及细胞培养的后续实验中，必须对相关内容及生物伦理问题给予特别关注。对特定设备的可视化演示至关重要，例如自制的尺寸排阻色谱柱，以及纳米颗粒计数器和质谱仪的使用。

来自实验室的Antonella Raffo-Romero将协助演示该实验步骤。首先从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）。将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基转移至锥形管中，在1,200 ×g条件下离心10分钟，以沉淀细胞。

将上清液转移至新的锥形管中，再离心20分钟，以去除凋亡小体。然后将上清液转移至10.4毫升的聚碳酸酯管中。将管子放入70.1 TI转子中，在4°C条件下以100,000 ×g超速离心90分钟，使细胞外囊泡（EVs）沉淀。

离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL经0.2 µm滤膜过滤的PBS中。为分离EVs，通过清洗并灭菌玻璃层析柱，并在底部放置一个60 µL滤器，自制尺寸排阻层析柱；然后用交联琼脂糖凝胶过滤基质填充层析柱，制备成直径0.6 cm、高20 cm的固定相。

然后用 50 毫升 0.2 微米滤过的 PBS 冲洗该相。如有需要，可将层析柱于 4 摄氏度保存以备后续使用。将重悬的 EV 沉淀加至固定相顶部，并在持续向固定相顶部添加 PBS 的同时，收集 20 个连续的 250 微升组分。

各组分可在零下20摄氏度保存。为进行纳米颗粒追踪分析，用0.2微米滤膜过滤的PBS对每份组分进行稀释，并涡旋震荡以消除聚集体。将溶液装入1毫升注射器中，并将其放入自动注射泵内。

接下来，将相机设置调整至适当的屏幕增益水平和相机水平，然后点击“运行”。以1000的输注速率将样品注入分析室，持续15秒。随后降低流速并稳定流速，以进行视频记录，输注速率调整为25，持续15秒。

连续采集三段每段60秒的颗粒流动视频。然后在视频分析前调整相机水平和检测阈值。点击“设置”中的“确定”开始分析，分析完成后点击“导出”。

每次组分之间用一毫升0.2微米过滤的PBS冲洗系统。若进行透射电子显微镜分析，使用50千道尔顿的离心滤膜浓缩目标尺寸排阻色谱组分。进行蛋白质提取时，将50微升RIPA裂解液与EV样品在冰上混合5分钟。

将样品以500瓦特、20千赫兹超声处理三次，每次五秒。然后在4摄氏度下以20,000 ×g离心10分钟，去除囊泡碎片。蛋白质分离后，在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质迁移。

在室温下将凝胶中的蛋白质与考马斯亮蓝混合染色20分钟。然后切下每块有颜色的凝胶，并将其切成小块。按照文稿中的描述，对凝胶小块进行一系列连续洗涤。

然后使用真空浓缩仪将样品完全干燥。干燥后，在56摄氏度下，用含有10毫摩尔二硫苏糖醇的100微升100毫摩尔碳酸氢铵溶液进行蛋白质还原反应，反应时间为1小时。接下来，在避光条件下，用含有50毫摩尔碘乙酰胺的100微升100毫摩尔碳酸氢铵溶液进行蛋白质烷基化反应，反应时间为45分钟。

根据文稿说明清洗胶粒，并在真空浓缩仪上完全干燥。加入50 µL溶于20 mmol/L碳酸氢铵的胰蛋白酶，在37 °C条件下过夜进行蛋白质消化。次日，用50 µL 100%乙腈（ACN）在37 °C下振荡提取消化后的蛋白质30分钟，随后在室温下继续振荡15分钟。

然后用50微升含5%三氟乙酸（TFA）的20毫摩尔碳酸氢铵溶液连续搅拌提取蛋白质两次，每次20分钟。加入100微升乙腈（ACN），继续搅拌10分钟。随后，将蛋白质干燥并重悬于20微升0.1% TFA溶液中。

使用带有C18反相介质的10微升移液枪头对样品进行脱盐，以去除盐分并浓缩肽段。随后用乙腈（ACN）和0.1%甲酸洗脱肽段。使用真空浓缩仪将样品完全干燥，并重新溶解于20微升乙腈和0.1%甲酸中，用于液相色谱-串联质谱分析（LC-MS）。

将消化后的肽段上样至仪器中，并进行样品分析。为验证EV的分离效果，对每一份SCC组分进行纳米颗粒追踪分析。第五、六、七组分中的颗粒数量显著升高。

将这些组分合并为一个2F-EV阳性样本，并通过蛋白质印迹分析与EV阴性组分（1F-EV阴性和3F-EV阴性）进行比较。结果显示，热休克蛋白90存在于EV阳性样本及细胞裂解液对照中。EV阳性样本的电子显微镜观察显示，EV的大小分布在约100纳米至400纳米之间。

为了鉴定细胞外囊泡（EV）阴性样本中的污染蛋白并表征EV的蛋白质组成，进行了蛋白质组学分析。在1F-EV阴性样本与2F-EV阳性样本之间，以及2F-EV阳性样本与3F-EV阴性样本之间，对鉴定出的蛋白质进行了比较。通过这种非靶向方法，将536种蛋白质的数据提交至ExoCarta数据库，最终鉴定了86种与EV相关的蛋白质。

此外，该样本池还用于鉴定蛋白质相互作用及其相关的生物学功能。研究发现，EV阳性样本中的蛋白质在免疫和神经保护通路中发挥作用。通过PC12细胞和大鼠原代神经元评估了小胶质细胞来源的EVs对神经突生长的影响。

与对照组相比，EVs处理组观察到显著增加的外向生长。评估了巨噬细胞来源的EVs对胶质瘤细胞侵袭的影响，发现EVs会损害胶质瘤类球体的生长和侵袭能力。

需要牢记的最重要事项是在超速离心步骤中务必仔细弃去上清液，以防止在此过程中外泌体（EVs）的损失。我们倾向于采用大规模且非靶向的方法，首先关注外泌体的全部蛋白质成分，进而研究其生物学效应，因此可通过分析手段关联核酸中的内容物。

通过这种原代培养的方法，我们能够区分细胞外囊泡（EV）蛋白与存在于囊泡外的游离蛋白。因此，问题仍然在于这种聚集是人为假象，还是确实存在其他真实的生物学机制。