通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

数十年来，蛋白质在细胞超微结构背景下的定位一直是强大的研究工具。通过本方案，我们拓展了对丰度较低或难以定位的蛋白质的研究。我们采用荧光显微镜以灵敏且可筛选的方式标记蛋白质，并结合电子显微镜技术重建细胞的超微结构。

在此，我们将以自噬蛋白为例演示切片上的 CLEM 技术，但该方法实际上可应用于任何关注细胞超微结构的生物学问题，尤其是在研究罕见事件时。与我共同示范该实验流程的是我们实验室的高级研究技术员 Tineke Veenendaal。首先，将含有 0.15% 甘氨酸的 PBS 替换为预热至 37 摄氏度的含 1% 明胶的 PBS。

用刮取法将明胶中的细胞转移至微量离心管中。在微量离心机中，于室温下以 6,000 G 离心 1 分钟，使细胞沉淀，随后小心去除明胶，避免扰动沉淀。向沉淀中加入预热至 37 摄氏度的 12% 明胶溶液，使用预热至相同温度的移液枪头或玻璃巴斯德吸管轻轻吹打重悬细胞。

在37摄氏度下孵育10分钟，然后在6,000 G下离心1分钟以沉淀细胞。将明胶置于冰上固化30分钟。若要从管中取出包埋在明胶中的细胞，可用剃刀片将含有沉淀物的管端从其余管体上切下。

然后将含有细胞沉淀的管端沿垂直于第一次切割的方向切成两半。将含有细胞沉淀的两个管端半部分放入2.3摩尔蔗糖溶液中，在4摄氏度下孵育10分钟。这会导致细胞沉淀半部分略微收缩，并从塑料管上脱落。

从蔗糖中取出带有明胶包埋细胞沉淀的离心管半片，然后用镊子将细胞沉淀半片从塑料离心管半片中取出。使用剃刀刀片手动将沉淀切成适当大小的组织块，并在切割过程中使用体视解剖显微镜对样本进行放大观察。将细胞组织块在2.3摩尔蔗糖溶液中、4摄氏度条件下孵育过夜。

将样品放置在铝制样品台针上。在样品块边缘保留足够的蔗糖，使其在样品块与针之间形成一层薄薄的环状结构。快速冷冻后，置于液氮中保存。

修整样品块前端，使其表面平整，以获得约250纳米厚的切片。然后使用刀片角在样品块面的侧面切去50至100微米，修整块面的四个侧面，形成一个约250乘以375微米的凸出矩形。

从突出的矩形区域切取切片，确保切片厚度在70至90纳米之间，并具有银金色光泽。使用粘在细棒上的毛发将切片从金刚石刀刃处引开，形成连续的切片带。将3毫米的捞取环浸入由2.3摩尔蔗糖与2%甲基纤维素等体积混合的溶液中，以捞取切片带。

将载网环插入切片机的冷冻室中，待液滴开始冻结后，轻轻将液滴压向切片，迅速拾取切片。将载网环从冷冻室中取出。等待液滴完全融化后，将液滴压在预先准备好的载网上。

将带有切片的载网置于盛有约1毫升PBS的小皿或多孔板中，在37摄氏度下孵育30分钟。将载网置于Parafilm上的约75微升液滴中进行后续处理，并在室温下用PBS-甘氨酸溶液洗涤。将载网在封闭缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白C和0.5%鱼皮明胶的PBS溶液）中室温孵育10分钟，以完成封闭步骤。

将一抗用 PBS 中的封闭缓冲液稀释，并将载网置于约 10 微升该溶液的液滴上，室温孵育 1 小时。用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 在室温下洗涤载网 5 次。用 PBS 中的封闭缓冲液稀释二抗和 DAPI。

然后将载网置于约10微升该溶液的液滴中，在室温下孵育30分钟或更长时间，随后如前所述用PBS洗涤载网五次。为将样品封片用于光学显微镜观察，将载网浸入蒸馏水中含50%甘油的溶液中，室温下处理两次，每次5分钟。将每个载网置于载玻片与盖玻片之间，滴加50%甘油，每张盖玻片下放置一个载网，并确保切面朝向盖玻片。

对于光学显微镜观察，将带有夹心网格的载玻片置于配备自动载物台的宽场显微镜下。选择高倍油镜物镜，对切片条带进行图像拼接成像。随后，为进行脱片处理及透射电子显微镜（EM）染色，于载玻片与盖玻片夹心结构的一侧加入10 µL蒸馏水，静置直至毛细作用使水充满盖玻片与载玻片之间的界面。

小心取下盖玻片，避免将浸油混入甘油中。用镊子取出载网，将其浸入蒸馏水中，在室温下清洗三次，以去除50%甘油。用无绒纸巾小心擦干载网背面，然后将载网切面朝下放置在蒸馏水滴上。

为了在透射电子显微镜下增强切片的对比度，将切片在室温下与醋酸铀酰孵育5分钟。通过将滴加在冰上金属板的Parafilm上的甲基纤维素醋酸铀酰溶液放置于冰上，使其冷却。然后用此冰冻溶液洗涤载网两次，并将载网在该溶液中孵育10分钟。

通过将网格干燥环插入每个网格下方的醋酸铀酰甲基纤维素液滴中，轻轻提起，使网格从液滴上脱离，从而将网格取出。用无绒滤纸吸取多余溶液时，将干燥环以约60度角轻触滤纸，并缓慢沿纸面拖动，直至不再有溶液被吸收。将带有网格的干燥环放入合适的支架中，在室温下静置干燥10分钟以上。

利用光学显微镜获得的概览图像，在透射电子显微镜（TEM）中定位感兴趣的成像区域，并在光学显微镜数据集中标注该感兴趣区域。选定区域后，在透射电子显微镜中以20,000倍至50,000倍的放大倍数获取图像瓦片集。在后期处理软件中重建该图像瓦片集。

根据DAPI信号、荧光信号以及电子显微镜下的细胞核轮廓进行图像关联。移动图像以实现精确叠加，并准确完成手动关联。肝母细胞瘤来源的HEPG2细胞在固定前于EBSS中饥饿处理两小时，随后用4%多聚甲醛固定两小时。

对切片进行LC3和LAMP1的免疫荧光成像显示，LC3点状结构相对较少，且与LAMP1的共定位信号较弱。通过基于DAPI和细胞核轮廓叠加免疫荧光图像与电镜获得的超微结构信息，将免疫荧光的分子信息与电镜的超微结构信息关联起来。LC3阳性细胞器与电镜超微结构的相关性分析表明，不同的点状结构代表自噬的不同阶段。

此处展示了由方框一示例的单个LC3标记区室的超微结构。左侧显示的是相关联的光学显微镜与电子显微镜图像，右侧为伪彩色电子显微镜图像。自噬体的内膜和外膜分别由白色和黑色箭头指示。

有趣的是，电子显微镜发现相对较弱的荧光信号点为 LC3 阳性的自噬溶酶体，其特征为致密的内容物和腔内小泡。这表明在超薄冷冻切片的免疫荧光中 LC3 可见性极低，提示尽管处于降解性环境，稳态下的自噬溶酶体中仍可检测到 LC3。然而，LC3 阳性的点状结构主要代表自噬体，仅有少数代表自噬溶酶体。

对于希望进行免疫胶体金标记而非切片上CLEM的研究人员，此处描述的方案和技巧同样完全适用于免疫胶体金标记。我们最初将切片上CLEM应用于低丰度的内体调控蛋白，并首次揭示了这些蛋白在内源性超微结构中的定位。