分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

富集分枝杆菌的细胞外囊泡有助于明确其内容物，解析其亚群，并为设计构建和生成主要利用疫苗候选抗原的重组细胞外囊泡提供依据。这些囊泡有六个亚群，来源于细菌表面的不同区域，且不具有保守的标志分子。

因此，任何基于亲和力的方法都只能富集细胞外囊泡（EV）中的一部分。相比之下，我们的方法能够捕获所有产生的分枝杆菌EV。演示该实验操作的是我实验室的博士生Mohd Ilyas。

首先，将1毫升野生型或重组耻垢分枝杆菌的甘油菌种加入含有10毫升预热的7H9液体培养基的50毫升离心管中。盖紧管盖并轻轻涡旋混匀，随后在37摄氏度、200至220转/分钟的条件下过夜培养。次日，当600纳米处的光密度值达到约1时，在室温下以3,200 ×g离心10分钟，弃去上清液至液体废弃物容器中。

加入1 mL预热的Sautons培养基，轻轻重悬以获得均匀的悬浮液。用Sautons培养基定容至10 mL。再次离心，弃去上清液。

洗涤后，将细菌细胞重悬于20毫升预热的Sautons培养基中，并在600纳米处测定光密度。将所需体积的细菌悬液接种至含有330毫升Sautons培养基的1至2升锥形瓶中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养，直至光密度达到0.3。

第二天，按照之前的方法洗涤细胞一次，并将沉淀重悬于含有1/10 Tween 80的330毫升Sauton培养基中。将50毫升细胞悬液分装至六个1升的锥形瓶中，每个锥形瓶中预先加入280毫升预热的含有1/10 Tween 80的Sauton培养基。于37°C、200 RPM条件下培养，直至菌液光密度达到2至2.5。

将两升处于对数中期的培养物加入六个400毫升的瓶子中，在4°C条件下以8,000 G离心20分钟。收集上清液以及预冷的灭菌锥形瓶或烧杯，并保留一份沉淀物用于分析程序。如果EVs为mCherry重组型，沉淀呈红色；若为野生型或非荧光蛋白重组型，则呈棕色。

将培养上清液先通过0.45微米的一次性滤器过滤，再通过0.22微米滤器过滤，以彻底去除细菌残留。接着，在4,000 G、4摄氏度条件下，用15毫升双蒸水预清洗30千道尔顿超滤离心管20分钟。然后在相同条件下，用15毫升预过滤的冷萨顿培养基洗涤，以彻底去除化学物质残留。

洗涤后，将15毫升过滤后的培养上清液加入浓缩管中，在4,000 G、4摄氏度条件下离心浓缩20分钟。将浓缩液转移至预冷的40毫升Oak Ridge离心管或新的50毫升Falcon离心管中。待全部两升培养滤液浓缩完成后，将浓缩液转移至经双蒸水冲洗并预冷的50毫升聚丙烯离心管中，并进行两步离心处理。

先在 4,000 G 条件下离心，然后在 15,000 G 条件下离心。将离心后的浓缩物转移至预冷的 38.5 毫升超速离心管中，在 4 摄氏度下以 100,000 G 离心 4 小时。将上清液收集至预冷的 50 毫升新鲜 Falcon 离心管中。将超速离心管倒置在一张新的无绒吸水纸上，以去除残留的上清液痕迹，并将沉淀物重悬于 600 微升 HEPES 缓冲液中。

将重悬的沉淀物小心地铺于一支预冷的13毫升UltraClear聚丙烯超速离心管底部，并与4毫升惰性的60%密度梯度碘克沙醇溶液轻轻混合。随后依次覆盖1毫升40%、30%、20%和10%的碘克沙醇溶液。最后在管顶加入4毫升6%碘克沙醇溶液，使管内液体充满。

将离心管小心地放入玻璃烧杯或支架中称重后，轻柔地将其转移至甩平转子的吊桶内，随后放入转子中，在4°C条件下以141,000 G超速离心16小时。超速离心结束后，小心取出离心管，将1毫升组分收集至已灭菌的微量离心管中。透射电镜分析显示分枝杆菌EVs呈圆形，纳米颗粒追踪分析证实存在不同尺寸的EVs，其直径范围在20至250纳米之间。

当mCherry的N端与CFP-29的C端进行翻译融合时，部分富集的Msm mEVs呈现粉红色，表明cf-29具有携带外源目的蛋白的能力。随后利用CFP-29评估EsxA向Msm EVs中的递送。在Msm EVs中检测到少量Mtb的EsxA。

CFP-29 EsxA 3X FLAG 在 mEVs 中更稳定，并且积累水平更高。通过富集在不同生理条件下培养的分枝杆菌释放的 EVs，有助于了解其内容物的改变以及功能的修饰，这些变化决定了病原体持续的感染性、致病性及传播能力。