分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

该方法允许在严格的低铁条件下培养结核分枝杆菌，并从低铁培养滤液中纯化膜囊泡。由于已知铁限制可刺激膜囊泡的产生，本方案能够获得大量高纯度的膜囊泡，可用于进一步的生物化学或功能分析。当使用非致病性的耻垢分枝杆菌演示该方案时，该方案同样可在生物安全二级（BSL-2）设施中用于致病性的结核分枝杆菌。

首先，在塑料容器中将五克磷酸二氢钾、五克L-天冬酰胺、20毫升甘油和两克右旋葡萄糖溶解于900毫升去离子水中，配制一升最小培养基。用5 N氢氧化钠将pH值调节至6.8，并用去离子水定容至一升。然后加入50克金属螯合树脂，使用磁力搅拌子在4摄氏度下轻轻搅拌24小时。

第二天，停止搅拌，让树脂沉淀约30分钟。使用带有塑料接收器的22微米滤器单元过滤溶液，以除去残留的树脂并实现灭菌。然后，在最低培养基中添加0.5毫克/升氯化锌、40毫克/升硫酸镁和0.1毫克/升硫酸锰。

将一株结核分枝杆菌单菌落接种于2 mL添加了ADN增补剂的分枝杆菌液体培养基中，在37°C条件下振荡培养。当出现可见生长时，取2 mL培养物，在分光光度计上测定其540 nm处的光密度（OD 540）。

当 OD 540 达到 0.8 时停止培养，这表明已进入对数生长后期。取 200 微升对数生长后期的培养物，均匀涂布于添加了 0.2 甘油、0.5% 吐温 80 和 ADN 的分枝杆菌琼脂平板上。至少接种五个平板。

将培养皿在37摄氏度下孵育。一周后，细菌生长形成融合的菌层，肉眼可见。然后用低铁最低培养基润湿一支无菌棉签。

使用该拭子从琼脂平板上采集细菌。将细菌接种于试管中含100毫升低铁最低培养基的液体中。采集足够的细菌以制备OD 540为1的菌悬液。

用低铁最低培养基将悬浮液稀释10倍至一升，并分装到两个无菌塑料瓶中。接着，将2毫升培养物转移至5毫升培养管中。加入10微升10%（体积比）的tyloxapol。

将培养物在 37 摄氏度下孵育 14 天。将培养物转移至五个 225 毫升的锥形离心管中，在 20 摄氏度下以 2,850 × g 离心 7 分钟。用 50 毫升移液管收集培养上清液，并通过 0.22 微米滤膜过滤除菌。

为了分离MEVs，将培养滤液转移至置于4°C的搅拌式超滤系统中，通过100千道尔顿截留分子量的滤膜在低于50 PSI的压力下进行过滤浓缩。随后，在4°C条件下，以15,000 × g离心15分钟，将浓缩后的培养滤液离心，并将上清液收集至聚碳酸酯超速离心管中。接着，在4°C条件下，以100,000 × g离心2小时。

随后，弃去上清液，并通过轻柔吹打，将膜性沉淀物重悬于总共一毫升的无菌 PBS 中。取 0.5 毫升沉淀悬液，与 1.5 毫升 60% 碘克沙醇溶液混合，置于聚丙烯薄壁超速离心管底部。依次在该 MVE 碘克沙醇 45% 悬液上方覆盖一毫升 40%、35%、30%、25% 和 20% 碘克沙醇溶液，以及一毫升 PBS 于最上层。

在4°C条件下，以100,000 × g离心18小时。随后，使用1毫升Hamilton注射器从顶部开始收集1毫升密度梯度组分。将每份收集的组分用PBS稀释至20毫升，并在4°C条件下以100,000 × g离心2小时。

去除上清液，并用0.5毫升PBS重悬。将试管置于4摄氏度保存。为进行膜脂分析，将每份梯度组分各取10微升，加入终浓度为每毫升1微克的荧光膜探针TMA-DPH，在96孔黑色板的每个孔中用50微升PBS配制混合液。

将培养板在 33 摄氏度下孵育 20 分钟。以 360 纳米为激发波长、430 纳米为发射波长测定荧光。在本方案中，MEV 通过密度梯度差速沉降法进行纯化。

在所述条件下，MEV 主要分离于梯度组分三，对应 25% 碘克沙醇。点印迹分析显示，囊泡相关蛋白在组分三中富集。负染色法也证实了组分三中存在 MEV，纳米颗粒分析显示 MEV 的大小约为 100 纳米。

将蛋白质和脂质浓度归一化至菌落形成单位后，结果显示，在低铁条件下，MEV 产量相较于高铁条件约增加八倍。点印迹分析显示，与铁充足条件下的结核分枝杆菌培养物相比，铁限制条件下结核分枝杆菌培养物的密度梯度组分中 MEV 相关标志物信号更强。请遵循最低限度培养基的制备说明，以确保铁限制条件，并防止膜囊泡被脂蛋白聚集体污染。

通过此方法纯化的分枝杆菌膜囊泡可用于生化表征和功能分析。