Bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

使用传统方法对枯草芽孢杆菌孢子进行细胞计数可能是一项费力的工作，因为这些方法完全依赖人工操作，且准确性取决于操作人员的经验。本方案可实现对休眠和萌发孢子的计数。此外，该技术还可用于测定其表面荧光蛋白结合的百分比。

鉴于本方案中存在设置步骤，该演示展示了实施过程中所需的设备条件、技术理解以及细致的操作。首先登录流式细胞仪软件。在软件工作区中，选择流式细胞仪，然后选择流路启动。

然后选择清洁模式。最后，启动SIT冲洗。取50 µL的高压灭菌孢子，加入终体积浓度为0.05%（v/v）的溴化乙锭，避光孵育30分钟。

用 PBS 洗涤孢子三次，每次在 17,949 G 离心 10 分钟，然后重悬于 PBS 中。接着，根据生产商推荐的稀释比例加入 10 微升微珠，并使用流式细胞仪分析样品。以阴性对照为参考，根据颗粒的形态学参数和荧光特性确定设门策略。

然后轻轻混匀试管。将其连接到流式细胞仪探针上，点击“采集”。为设置激光功率，请进入细胞仪窗口中的参数选项卡，将前向散射调整为375，侧向散射调整为275。

然后选择阈值选项卡，并将其设置为500。接下来，分析仅含孢子的无染料样品，以消除自发荧光。在参数选项卡中，调节滤光检测器三的电压至603，滤光检测器五的电压至538，以便通过对照中的荧光信号区分阴性和阳性群体。

然后点击补偿（Compensation），将滤光检测器5的3倍设置偏移量设为1。为配置设备进行数据采集，选择实验（Experiment），选择实验布局，并将采集参数设置为30,000个事件。调整参数后，在流式细胞仪中对已标记并含有微球的样品进行数据采集。

将50微升孢子在17,949 G下离心10分钟。接着，用25微升1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺重悬孢子，并孵育15分钟。随后，向孢子悬液中加入25微升浓度为50毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠。

将孢子悬液在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤孢子三次，每次洗涤均按前述方法进行离心。向样品中加入荧光蛋白，并在15摄氏度下孵育过夜。

加入终浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭，按1:50稀释后，将样品置于冰上避光孵育1小时。在洗涤孢子并如前所示设定门控后，调整点图中X轴的滤光检测器三和Y轴的滤光检测器五的参数。计数微球法检测到高压灭菌孢子样品中每微升含有2×10³个孢子。

对高压灭菌孢子样本进行溴化乙锭染色后，其平均荧光强度高于未高压灭菌孢子的染色结果，表明遗传物质的染色程度更高。高压灭菌孢子表面与APC标记的抗人白细胞介素10抗体结合时，表现出比未高压灭菌孢子更高的偶联效率。孢子对溴化乙锭的通透性表明，在总孢子群体中可能存在已萌发的孢子。

根据流式细胞术分析结果，观察到荧光抗体与休眠孢子的结合比例高于与萌发孢子的结合比例。此外，随着荧光抗体浓度的增加，结合孢子的百分比和平均荧光强度也随之升高。为确保通过流式细胞术获得精确的读数和准确的孢子计数，对当前微珠进行充分均质化处理至关重要。

标准化连接在孢子上的抗原浓度，加拿大研究分析了利用孢子作为疫苗抗体的应用。