利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（SVEM）优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂的流程

本文为科研人员提供了一种构建实验设计表并分析多种混合与工艺因素下实验结果的工作流程，无需进行繁琐且可能不稳定的统计学决策。所得到的模型可对多个响应变量进行联合优化，并用于生成信息丰富的图形，以综合展示联合响应面以及各个响应变量的预测结果。这些图形比基础统计模型中的参数估计更易于解读，有助于呈现能够产生最优响应的因子设置条件。

脂质与纳米颗粒制剂科学家经常需要针对不同的载药物质，或在更换脂质成分或工艺参数时，构建新的制剂配方。我们提供一种稳健的配方优化方法，可最大限度减少实验设计构建过程中的出错风险，并避免在数据分析过程中对复杂统计学知识的依赖。请在带有日期戳记的文件中总结本实验的目的。

列出实验过程中将要测量的响应指标。选择研究中将要改变的因素以及将保持不变的因素。确定可变因素的取值范围以及每个因素相应的有效数字精度。

使用最小值和最大值启发法确定研究设计的规模。打开 JMP，导航至菜单栏中的 DOI、特殊用途、空间填充设计。输入研究的响应变量。

输入研究因素及其取值范围。输入设计预设的实验运行次数。生成所选因素和运行规模的空间填充设计表。

在表格中添加一个注释列，用于标注任何手动创建的运行。如果适用，将基准对照运行手动纳入设计表格中。对其中一个受控的基准包含一个重复。

在备注列中标记基准名称，并对基准重复行进行颜色编码，以便于准确识别。将因子水平的混合值四舍五入至适当的粒度。复制四舍五入后的数值，并粘贴回原始列中。

删除圆整后列的冗余副本。在对脂质因子进行圆整后，验证其总和等于100%。若任何行的总和不等于100%，则手动调整其中一个混合因子，确保其仍处于因子范围内。调整完成后，删除总和列。

采用与混合因子相同的四舍五入方法，将过程因子四舍五入至相应的粒度。将脂质列的格式设置为显示指定小数位数的百分比形式。如果您添加了手动运行的实验（例如基准测试），请重新随机化表格的行顺序，并添加一列包含四舍五入后的数值。

右键单击该列标题，将其按升序排列，然后删除该列。生成三元相图以可视化脂质因素中的实验设计点。同时检查工艺因素中的实验运行分布情况。

配方研究人员应确认所有试验运行的可行性。若存在不可行的运行，请重新启动实验设计，考虑新发现的约束条件。按照设计表格中提供的顺序进行实验。

将读数记录在实验表格中内置的列中。绘制读数图表并检查响应值的分布情况。如果包含颜色编码的重复运行，则检查这些重复运行之间的相对距离，这有助于理解在基准条件下整个流程和分析变异的总体情况，以及与因子空间内不同因子设置变化所引起的变异之间的比较。

在三元相图上绘制运行点。根据响应值对点进行着色，以获得混合因子影响下行为的、独立于模型的视图。右键单击生成的任意图形，选择“行图例”，然后选择响应值对应的列。

对每个响应变量重复此步骤。针对每个响应变量，分别建立关于研究因子的独立模型。删除由空间填充设计创建的模型脚本。

选择“分析”，然后选择“拟合模型”。构建一个包含所有候选效应的完整模型。该模型应包括各因子的主效应、二阶和三阶交互作用项、过程因子的二次项和部分三次项，以及混合因子的Scheffe三次项。

选择所有研究因素。将“度”的条目从默认的“二”更改为“三”，然后选择“到指定度的因子设计”。

仅选择非混合因素，然后选择宏，部分三次方。仅选择混合因素，然后选择宏，谢费三次方。取消勾选默认的“无截距”选项。

指定响应列，将“人格”更改为“广义回归”。将此模型设置保存到数据表中以便于调用。选择“保存到数据表”。

单击“运行”。在估计方法中，选择 SVEM 逐步回归法。展开“高级控制”中的“力项”菜单，并取消勾选与混合主效应对应的复选框。

仅保留截距项选中状态。点击“确定”。通过将实际响应值与SVEM模型预测的响应值进行绘图，以验证其预测的合理性。点击SVEM正向选择旁边的红色三角形，选择“保存列”中的“保存预测公式”。

这将在数据表中创建一个包含预测公式的新增列。对每个响应变量重复上述建模步骤。当所有响应变量的预测列均已保存至数据表后，使用轮廓分析（profiler）功能绘制所有预测响应列的响应轨迹。选择“图形”（Graph）→“轮廓分析”（Profiler），并将上一步中创建的所有预测列选为 Y 预测公式，点击“确定”（Okay）。

确定候选的最佳配方。为每个响应变量设定期望函数，明确其应被最大化、最小化或匹配至某一目标值。同时需设定各响应变量的相对重要性权重。

为生成首个候选方案，将所有主要响应设置为重要性权重1.0，所有次要响应设置为重要性权重0.2。指示分析器寻找可最大化期望函数的最优因子设置。选择“优化期望值”中的“最大化期望值”。

记录最优因子设置，并注明各响应变量所使用的重要性权重。对于离子化脂质类型等分类因子，需针对每个因子水平找出条件最优的配方。首先，在轮廓图中设置各因子的期望水平。

然后按住控制键，同时在该因子的图表内单击鼠标左键，选择“锁定因子设置”。选择优化与期望值，并最大化期望值，以在该因子保持当前设定的条件下找到最优值。完成后，在继续下一步之前，请先解锁因子设置。

在修改响应变量的重要性权重后，重复优化过程，可能仅优化主要响应变量，或将某些次要响应变量的重要性权重设为更高或更低，同时将其目标设为“无”。记录新的最优候选方案。生成因子空间最优区域的图形化总结。

创建一个包含 50,000 行的数据表，其中填充了在允许的因子范围内随机生成的因子设置，以及每个响应变量的简化模型对应的预测值和联合期望函数。选择“输出随机表”。将要模拟的运行次数更改为 50,000，然后点击“确定”。

在新创建的表格中，添加一个新列，用于计算“期望值”列的百分位数。在三元图中使用该百分位数列，而非原始的期望值列。右键单击“期望值”列标题，然后选择“新建公式列”、“分布”，再选择“累积概率”。

生成以下图形。反复更改图形的配色方案，以分别显示每个响应变量以及累积概率列的预测结果。针对四种脂质因子构建三元相图。

在表格中，导航至图形三元相图。选择用于 X 轴作图的混合因子，然后点击“确定”。在生成的图形之一中单击右键，选择“行图例”，然后选择预测响应列。

将颜色下拉菜单更改为 Jet。这将显示相对于脂质因子表现最佳和最差的区域。当前图像显示了在考虑将效价最大化（重要性序列为 1）和将粒径最小化（重要性序列为 0.2）时联合可取性值的百分位数。

在三元相图坐标轴未显示的因素上进行平均化处理。反复更改图形的颜色方案，以展示每个响应变量的预测结果。类似地，将代表不同配方的50,000个以颜色编码的点，针对非混合过程因素单独或联合作图，观察响应变量与各因素之间的关系。

寻找能使点产量达到最高合意度的因子设置。该图显示了使用三种离子化脂质类型中的每一种所能形成的全部配方的综合合意度。最理想的配方采用H102，而H101可提供一些潜在的有竞争力的替代方案。

探索可能导致不同响应的各种因素组合。将预测剖面图及其保存的设置重新保存至数据表中。准备一个表格，列出先前确定的最优候选方案。

在将要配制和测定的一组候选样品中包含基准对照。如果实验中的任何配方被发现产生理想结果，例如优于基准对照，则选择其中最佳的配方加入候选表格，并与新配方一起重新测试。在分析仪中右键单击已保存的设置表格，然后选择“生成数据表”。

进行验证实验，构建配方并收集读数。比较候选最优配方的性能。该工作流程已应用于多种场景。

在大多数情况下，与采用单因素优化方法确定的基准配方相比，我们观察到其效价至少提高了四到五倍。当同时针对次要响应指标进行优化时，改进效果尤为显著。此外，还可以通过模拟来展示该方法所获得的最优候选配方的预期质量。

利用本文所述示例实验中已知的数据生成函数，我们可以比较通过本工作流程中使用的空间填充设计和基于SVEM的分析所获得的候选最优配方，与通过传统混合物分析技术所获得配方的质量。图中垂直轴表示最优配方的质量，水平轴表示实验设计中的运行次数，蓝色点代表在150次模拟中未缩减的完整统计模型的表现，琥珀色点代表基于AICC目标函数的传统单次前向选择方法的表现。

绿色点代表本工作流程中采用的基于 SVEM 的前向选择方法的性能。SVEM 分析使我们能够获得更优的候选方案并减少实验次数。对于某些复杂性较高的研究，可能需要统计学家在实验设计和数据分析方面提供协助。

对于极高优先级的研究，若运行规模通常较小，或存在大量分类因子，或某个单一分类因子具有较多水平，则统计学家可能会采用不同的方法。此时可使用最优设计或混合设计，以替代工作流程中指定的空间填充设计。