示踪 从头合成 使用稳定同位素标记的液相色谱-传输区离子淌度-飞行时间质谱/质谱分析脂质

本研究旨在利用稳定同位素标记对脂质血样样本进行更精确的定量分析，从而帮助我们理解从昆虫到人类等高度多样化样本中的脂质谱。目前，在脂质组学研究中，液相色谱-迁移率-飞行时间质谱（LC-TIMS-TOF MS/MS）技术的标准化方面仍存在空白。

在此，我们提供了一种用于追踪生物质残留的方法。未来，我们的研究将利用 LC-TIMS-TOF MS/MS 结合 DDA 和 DIA 方法，探究该生物过程中存在的表观遗传学和代谢组学特征。开始进行 LC-TIMS-TOF MS/MS 的质谱仪（MS）校准时，打开 TIMS 控制软件，在校准子选项卡下，点击 M over Z，从下拉框中选择调谐混合物（tuning mix），然后单击右下角的“校准”按钮。

持续点击校准，直至达到100%的评分。现在选择迁移率选项卡，并按照演示的相同步骤操作，直到校准评分达到100%。为生成校准曲线中的每个校准点，向脂质内标混合物中加入10 µL氘代内标混合物。

在所需范围内制备七份此类加标样品，用于七个校准点。使用数据分析软件，根据被动二级质谱（MS/MS）图谱手动标注脂肪酸链。为确定稳定同位素标记（SIL）效率，计算含有稳定同位素标记（SIL）的峰面积与不含SIL的峰面积的比值。

通过确定在任意位点找到标记原子的概率，计算理论谱型。使用数据分析软件将实验同位素谱图与模拟的理论谱型进行拟合，从而计算稳定同位素标记（SIL）的富集度。启动运行时，单击温度计按钮以启动色谱柱温箱，并单击阀门按钮以启动泵。

将质谱方法设置为先前保存的适当方法。确认进样体积为5 µL，并将第一行目标样品瓶设置为20至1，保存样品列表。启动序列，并通过系统显示的“已进样”消息确认进样成功。

复制第一行并将其粘贴在下方以生成新的第二行。根据实验需要在第二行中添加样品，并确保使用自动进样器中的正确位置。如果流动相为新配制，请首先使用生产商提供的脂质混合标准品进行峰形测试，以便与先前结果进行比较。

屏幕上显示脂质混合物和标准品。确保新添加的色谱线使用正确的分离方法，而非第一条线所用的预平衡方法。确认输入的质谱（MS）方法正确无误。

检查是否已加载正确的处理方法，并确保已启用运行自动处理流程。保存样本列表，以确保在当前运行结束后对样本进行分析。首先，打开数据分析软件。

在左上角，单击文件按钮并选择打开。要选择所需文件，请右键单击文件名并选择属性，然后选择校准状态。

在下拉框中选择质谱仪的内标校准。确保所有误差均小于百万分之一。然后选择离子淌度内标校准，并确认误差小于百万分之一。

接下来，右键单击色谱图并选择编辑色谱图。在“类型”中，点击下拉框并选择提取离子色谱图。在“滤镜”下，选择所有质谱（MS），在扫描模式中选择“全部”，以查看目标分子的峰，而不仅限于其碎片离子。

分子筛选有两种滤波选项：质量或分子式。若选择质量，请选定目标分子的理论质荷比（M/Z），本例中为829.7985。若选择分子式，请选定目标分子的分子式及其离子形式，本例中为铵离子（ammonium）。

对于宽度，选择正负一。对于极性，确保保持正离子模式。在迁移率设置中，选择1.455至1.465，以分离目标分子并过滤掉不在此范围内的分子。

选择参数后，单击“change”，然后单击右上角的“OK”。短暂等待后，软件将处理所选参数并输出色谱图。在目标峰起点的基线处单击鼠标右键，按住并拖动至峰的末端，即可获得该保留时间内片段的实时质谱图。

在屏幕左侧的迁移谱图上单击右键，然后选择“编辑迁移谱图”。此时将出现一个名为“编辑迁移谱图轨迹”的窗口。请按照之前演示的步骤进行操作。

对于保留时间，请输入目标峰的保留时间。参数选择完毕后，单击“添加”，然后单击右上角的“确定”。等待软件处理所选参数并输出色谱图。

为提取离子，请重复之前演示的步骤，直至生成离子列表。在质谱窗口底部，选择“profile MS”和“fragment MS”，以在被动模式下全扫描获得离子的谱图视图。对于谱图视图，右键单击并选择“copy compound spectrum”以复制化合物谱图。

右侧显示的谱图数据可提供有关化合物的更多信息，例如分辨率、分辨能力、强度以及信噪比。为处理数据，需手动积分色谱图和迁移率峰，以获得目标分子的有价值信息。右键单击“查找”，然后手动选择色谱图或迁移图中的化合物。

左键单击并高亮选择目标峰。获得的信息包括保留时间、峰面积、信噪比和迁移率。