细胞外囊泡组织因子活性检测
2023年12月29日
本文介绍了一种实验室自建的细胞外囊泡组织因子活性检测方法。目前已采用基于活性的检测方法和基于抗原的检测方法来测定人血浆样本中细胞外囊泡的组织因子含量。其中，基于活性的检测方法比基于抗原的检测方法具有更高的灵敏度和特异性。
不同疾病的患者血浆中存在低水平的组织因子阳性细胞外囊泡。然而，大多数基于抗原的检测方法（包括ELISA和流式细胞术）缺乏足够的灵敏度来检测这些低水平的物质。已有大量文献采用ELISA或流式细胞术检测血浆中的组织因子。
本方案以高灵敏度和高特异性检测血浆中组织因子的活性，但由于采用功能测定法，存在一定变异。目前有商业化的检测试剂盒可用于测定血浆中组织因子活性水平。然而，这些试剂盒不含抗组织因子抗体，因此无法区分组织因子依赖性和非组织因子依赖性的因子X生成。
首先，在37摄氏度下解冻分离的血浆样本。将每个血浆样本的100微升转移至1.5毫升离心管中。向每根离心管中加入1毫升无钙HBSA缓冲液。
在4°C条件下，以20,000 G离心样品15分钟。小心吸除上清液，保留约20微升，切勿扰动沉淀。随后，向每根试管中加入1毫升无钙HBSA缓冲液。
然后用移液器反复吹打以重悬沉淀。每管涡旋震荡数秒，确保细胞外囊泡均匀分布。随后在4°C条件下以20,000 G离心15分钟。
再次吸取上清液，保留约 20 微升，注意不要扰动沉淀。然后用 80 微升无钙 HBSA 缓冲液重悬沉淀。反复吹打悬浮液，以获得均匀的悬浮状态。
为检测细胞外囊泡组织因子活性，首先将40微升细胞外囊泡样品加入96孔板的两个孔中。在第一个孔中加入11微升抑制性小鼠抗人组织因子IgG抗体，在另一孔中加入11微升对照小鼠IgG抗体。
孵育后，向每孔中加入50微升因子混合溶液。用封板膜覆盖酶标板，然后在37摄氏度下孵育两小时。加入25微升HBSA EDTA缓冲液以终止因子Xa的生成。
将显色底物用蒸馏水重悬至浓度为4毫摩尔。然后向每孔中加入25微升显色底物。用封板膜覆盖板孔，再用铝箔纸包裹。
将培养板置于37摄氏度下孵育15分钟。接着，在1,500 G离心力下离心1分钟，以去除任何气泡。然后将培养板放入酶标仪中，在405纳米波长下检测。
利用重组组织因子经再脂化后生成的标准曲线，将每孔的凝血因子Xa生成量进行转换。然后计算组织因子依赖的凝血因子Xa生成量。在11名供者中，有6名对脂多糖呈中至高反应性，而另外5名则为低反应性。
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概述
本文介绍了一种用于检测人血浆中细胞外囊泡组织因子活性的实验室自建检测方法。与传统的基于抗原的检测方法相比，该方法具有更高的灵敏度和特异性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
背景
- 在多种疾病的血浆中可发现低水平的组织因子阳性细胞外囊泡。
- 基于抗原的检测方法（如ELISA和流式细胞术）通常缺乏检测所需的灵敏度。
- 现有的商业试剂盒无法区分依赖组织因子和非依赖组织因子的X因子生成。
研究目的
- 通过提高灵敏度和特异性来检测血浆中的组织因子活性。
- 提供一种能够检测低水平组织因子的功能性检测方法。
- 克服现有基于抗原检测方法的局限性。
使用的方法
- 实验室内部的细胞外囊泡组织因子活性检测方法。
- 基于活性与基于抗原检测方法的比较。
- 检测组织因子的灵敏度与特异性的评估。
- 功能检测结果变异性的分析。
主要结果
- 基于活性的检测方法比基于抗原的检测方法具有更高的灵敏度。
- 功能性检测成功地检测到血浆中低水平的组织因子。
- 由于功能性检测本身的特性，结果存在一定的变异性。
- 市售试剂盒在区分组织因子活性方面被发现不够充分。
结论
- 该实验室自建检测方法为测定组织因子活性提供了可靠手段。
- 该方法相较于传统的基于抗原的检测具有显著优势。
- 该方法有助于加深对组织因子在多种疾病中作用机制的理解。
常见问题
行业应用价值
准确量化细胞外囊泡中组织因子（tissue factor）的活性，对于降低早期药物发现中血栓形成风险以及理解与疾病相关的凝血功能障碍至关重要。本研究所述的基于活性的检测方法能够灵敏且特异地检测携带TF的细胞外囊泡（EVs），支持在涉及凝血通路的适应症中进行作用机制靶点验证和研发管线筛选。该能力增强了从发现生物学向转化研究过渡阶段的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关的血浆样本中实现对组织因子活性的功能性检测。
- 通过区分组织因子依赖性和非依赖性的FXa生成，支持生物学风险评估。
- 提高在凝血和炎症通路中靶点验证的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的、用于检测细胞外囊泡相关组织因子活性的定量读数。
- 通过使用显色底物和标准曲线，促进检测方法的标准化和可重复性。
- 可在筛选实验中实现对化合物对组织因子活性影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过量化与疾病严重程度相关的组织因子（TF）阳性细胞外囊泡（EVs），契合转化生物标志物研究策略。
- 支持从发现到血栓形成和凝血功能障碍模型中临床前验证的连续性研究。
- 通过提供组织因子（TF）活性调控的机制性证据，降低研发推进决策的风险。
流程与工作流整合
该活性检测可融入从发现到临床前研究的连续流程，支持凝血相关项目的假设验证、靶点确证以及转化生物标志物的对接。
- 发现生物学：支持机制性假设验证，并阐明组织因子（TF）通路在疾病模型中的作用。
- 筛选：为化合物筛选和检测方法开发提供定量、可重复的输出结果。
- 分析：提供高灵敏度的FXa生成检测，并可对组织因子依赖性活性进行统计学区分。
- 转化研究：将发现阶段的研究成果延伸至血栓风险评估中的临床前生物标志物策略。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，用于跨多个项目进行功能性EVTF活性的检测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高转录因子相关靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强检测方法的标准化、可重复性和可扩展性，适用于跨项目应用。
- 战略价值：为“推进/终止”决策提供依据，降低凝血相关项目组合在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：支持对涉及组织因子（TF）通路的资产进行基于风险调整的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备凝血生物学和功能检测方法开发方面的专业知识。
- 需要具备酶标仪、离心设备以及经过验证的试剂的使用条件。
- 要求跨团队标准化操作，以确保实验可重复性和数据可比性。
- 可能需要根据不同的血浆来源或疾病模型进行适应性调整。
- 应通过严格的对照和标准曲线来控制功能检测的变异性。
