流式细胞术分析人血小板中组织因子的表达

在本方案中，我们提供了一步一步的教程，通过全血流式细胞术检测血小板相关组织因子，评估其在静息状态和激活状态下血小板胞内区室、停滞条件以及细胞表面的蛋白表达。使用DP（一种最常见的血小板激动剂）激活后，组织因子由一部分血小板表达。如果在富血小板血浆（PRP）或洗涤血小板中检测组织因子阳性血小板，则该亚群可能在样本制备过程中丢失。而采用全血进行检测时，则不会出现此类风险。

自本世纪初首次发表以来，血小板相关组织因子一直存在争议，主要由于分析前及方法学方面的问题。本方案阐明了这些问题，并被用于开展由国际血栓与止血学会（ISTH）支持的一项国际项目，以标准化血小板相关组织因子的检测。该检测采用流式细胞术，仅需数微升血液即可完成，适用于临床环境中的血小板相关组织因子分析。此外，样本可先固定再后续标记，使得该分析在众多医院和实验室中均可行。

首先，为每种抗体体积准备一个试管。在每个试管中加入一滴阴性珠和一滴阳性珠进行测试。向每个试管中加入20 µL的相应抗体稀释液，并涡旋混匀。

立即将试管在室温下避光孵育20分钟。然后向每支试管中加入1毫升不含钙和镁的pH 7.4 PBS溶液，涡旋混匀，并轻柔地倒置枸橼酸钠真空采血管5次，以充分混匀血液与抗凝剂。将50微升血液转移至一支1.5毫升离心管中。

然后加入 950 微升 1% 多聚甲醛。轻轻混匀，并在室温下孵育样品 90 分钟。现在将样品在室温下以 1,500 ×g 离心 5 分钟，刹车设置为室温。

去除上清液后，将沉淀物重悬于1毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中。在pH 7.4条件下，将100微升固定血液分装至各试管中，并在1,500 ×g下离心5分钟。室温中断后，去除上清液重新悬浮。

将沉淀重悬于100 µL含0.1%吐温的PBS中以通透样本，并在室温下孵育10分钟。首先，准备一管用于荧光减一对照，另一管用于组织因子染色。向每管中加入抗体至100 µL已固定并通透的全血中。

向每支试管中加入 300 µL pH 7.4 的不含钙和镁的 PBS，混匀。然后将染色后的样品避光保存，直至进行流式细胞术分析。用不含钙和镁的 PBS 稀释 α-CD142 HTF1 单克隆抗体以及 Alexa Fluor 633 标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白 G。接下来，准备三支样品管，并分别加入不含钙和镁的 PBS。

在 pH 7.4 条件下，加入 7.5 µL 稀释后的 alpha CD142 htf one 单克隆抗体，并加入 5 µL 二磷酸腺苷。轻轻倒置柠檬酸盐真空采血管 5 次，以充分混匀血液与抗凝剂。将 5 µL 全血分别加入每根试管中。

轻轻混匀样品，在室温下孵育20分钟。对于样品固定，向每根试管中加入300微升1% PFA，在室温下以1,500 ×g离心5分钟，并使用刹车。去除上清液后，将沉淀重悬于90微升不含钙和镁的PBS中。

在 pH 7.4 条件下，轻轻吹打，向每根试管中加入 5 微升稀释后的 Alexa Fluor 633 标记的免疫球蛋白 G 和 5 微升 α-CD41 PE。将样品在室温下避光孵育 15 分钟。然后向每根试管中加入 300 微升 pH 7.4、不含钙和镁的 PBS，并混匀。

首先，在对数尺度上创建一个前向散射面积与侧向散射面积的散点图，显示所有事件；再在对数尺度上创建一个CD61A与侧向散射面积的散点图，显示所有事件。为观察血小板群体，将侧向散射高度的阈值设为约2000，PerCP-Cy5.5 690/20 H的阈值设为1000。根据每日质量控制结果调整PE 585/42和PerCP-Cy5.5 690/20的增益，并将流速设为低速。随后，在10³至10⁵之间绘制一个区域，命名为CD61阳性。

为了鉴定血小板群体，随后复制FMO样本并将其重命名为TFIC。采集样本，并在CD61阳性门控内记录包含10,000个事件的数据文件。创建一个以对数尺度显示所有事件的前向散射面积与侧向散射面积的散点图。

创建一个CD41a和侧向散射面积的对数刻度点图，显示所有事件。然后根据每日质量控制调整Alexa Fluor 633的增益和PE-Cy5.5的增益。将侧向散射高度的阈值设为约1000，PE-Cy5.5高度的阈值设为2,500。为可视化血小板群体，将流速设为低速。

现在在10的4次方至10的5次方之间绘制一个区域，命名为CD41阳性，以识别血小板群体。然后为每个样本创建一个试管，并命名为TF未刺激和TF刺激。采集样本，并在CD41阳性门控离心条件下记录包含10,000个事件的数据文件。

将装有0.129摩尔柠檬酸钠的真空采血管在室温下以100 ×g离心10分钟，期间不得中断。然后从离心机中取出真空采血管。收集获得的富血小板血浆，转移至一个10毫升聚丙烯管中，并记录收集的体积。使用血细胞计数仪对富血小板血浆中的血小板计数两次。

通过αCD61抗体染色鉴定的血小板群体显示，约26.8%的循环血小板含有细胞内组织因子。流式细胞术分析表明，静息血小板中约有2.8%表达组织因子，在二磷酸腺苷激活后上升至24.5%。较大体积的血小板显示出更高的组织因子表达水平，其中绿色点代表较大体积的血小板亚群。流式细胞术分析证实，采用100 ×g离心制备的富血小板血浆保留了与全血相似的血小板群体，维持了高组织因子阳性率的较大体积血小板。

较高的离心力导致较大的组织因子阳性血小板丢失，这由PRP群体中前向散射信号的降低所表明。