利用细胞外囊泡激活凝血时间（EV-ACT）测定细胞外囊泡（EV）的促凝活性
2023年8月4日
本方案研究富含细胞外囊泡（EV）的血浆作为评估EV凝血能力的指标。通过差速离心法及随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。
我们的主要研究重点是脑外伤患者中的凝血功能障碍。在本研究中，我们尝试利用细胞外囊泡活性凝血时间来监测凝血功能的变化。我们的团队专注于脑损伤相关研究，在脑损伤中存在一种称为高凝状态的严重情况，这种状态难以准确测量。我们发现，患者血液中存在一些被称为细胞外囊泡的微囊泡，包括凋亡小体、微囊泡和外泌体。
它们在促凝血能力方面存在差异，因此我们必须找到一种方法来测定这种能力。通过该方法，我们可以快速准确地检测细胞外囊泡之间的差异，这一点非常重要。
基于这一检测方法，我们可以开展许多工作。我们已确认，在TPI小鼠和临床患者中，尤其是在外周循环中，会发生一些栓塞，这在临床上具有非常、非常严重的意义。与其它技术相比，我们的方案因其操作简便、成本低廉且速度快，具有显著优势。
它能够在床旁进行血液凝固检测，无需复杂的实验室处理。我们的研究已建立一种新方法，可检测外周血的高凝状态。该方法不仅可用于TPI，还可应用于子痫前期、肿瘤及血液系统疾病等其他疾病。
未来，我们计划研究EV ACT在临床高凝状态筛查中的应用，高凝状态会增加血栓形成的风险。首先，在室温下以120 ×g离心人全血20分钟，以去除血细胞，然后将上半部分的上清液转移至新管中。接着，将富血小板血浆再次离心以去除血小板，并将上半部分的上清液转移至新管中。
然后以13,000 G离心乏血小板血浆两分钟，去除细胞碎片。将上清液的上半部分转移至新管中，开启凝块分析仪以检测细胞外囊泡（EV）活化的凝血时间，并将仪器预热至37摄氏度。安装一次性探针和检测杯，然后启动仪器的质量控制程序。
完成质控运行后，将样本信息输入系统。然后向检测杯中加入 200 微升富含细胞外囊泡（EV）的血浆，随后加入 20 毫摩尔、170 微升的氯化钙。点击开始按钮，盖上盖子，使探针检测样本电阻的变化。
不合格的EV样本在EV门附近表现出一个明显且粒径略大的聚类。相比之下，合格的富含EV样本则显示大多数信号位于EV门内，形成单一主群。EV浓度增加会缩短EV活化凝血时间，而EV浓度降低则延长EV活化凝血时间。来自子痫前期、髋部骨折和肺癌患者的富含EV血浆样本，其EV活化凝血时间显著短于健康志愿者。
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概述
本研究通过监测细胞外囊泡（EV）活性来评估脑外伤患者血液凝固功能，探讨其凝血功能障碍。研究重点为难以测量的高凝状态，旨在建立一种方法，用于评估血液样本中EV的促凝活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 凝血障碍
- 细胞外囊泡
背景
- 脑创伤患者中凝血功能障碍较为常见。
- 细胞外囊泡（EVs）在凝血过程中发挥重要作用。
- 检测高凝状态较为复杂。
- 不同类型的细胞外囊泡具有不同的促凝活性。
研究目的
- 监测与细胞外囊泡（EV）活性相关的凝血功能变化。
- 建立一种测量细胞外囊泡（EV）凝血能力的方法。
- 加深对脑损伤病例中凝血机制的理解。
使用的方法
- 通过差速离心法收集富含细胞外囊泡的血浆。
- 对血浆样本进行再钙化处理以用于分析。
- 利用细胞外囊泡活性评估凝血功能。
- 监测微囊泡，包括凋亡小体和外泌体。
主要结果
- 确定了不同细胞外囊泡（EVs）在促凝活性方面的差异。
- 建立了一种快速评估凝血状态的方法。
- 阐明了细胞外囊泡（EVs）在理解凝血功能障碍中的重要性。
- 揭示了脑损伤与凝血之间关系的机制。
结论
- 该研究为测量脑创伤患者的凝血功能提供了一种新方法。
- 细胞外囊泡是凝血能力的关键指标。
- 需要进一步研究以探讨这些发现的临床意义。
常见问题
行业应用价值
量化细胞外囊泡（EVs）的促凝活性，有助于弥补在多种疾病背景下对高凝状态进行早期检测和风险评估的重要空白。EV激活凝血时间（EV-ACT）检测法可实现对EV驱动凝血的快速、床旁评估，支持转化研究中的机制性风险排除和靶点验证。该能力可在发现与临床前研究的关键转折点上提升预测的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究与疾病机制相关的细胞外囊泡（EV）介导的凝血通路。
- 通过定量EV的功能性促凝活性，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于验证调控EV释放或活性的干预措施的靶点。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化的定量检测方法，用于评估血浆样本中细胞外囊泡（EV）的促凝血功能。
- 提供可重复的实时黏弹性测量结果，适用于检测方法的优化。
- 能够快速筛查多种疾病模型样本的高凝状态风险。
转化与临床前研究
- 通过检测子痫前期、创伤和癌症样本中由细胞外囊泡（EV）驱动的高凝状态，与疾病相关模型相一致。
- 支持从凝血生物标志物的机制发现到临床前验证的连续性研究。
- 为靶向EV通路的候选治疗药物提供基于风险评估的推进决策依据。
流程与工作流整合
EV-ACT 检测通过在健康和疾病状态下对细胞外囊泡（EVs）进行功能评估，整合到从发现到临床前研究的连续过程中。
- 发现生物学：定量分析细胞外囊泡介导的促凝活性，以阐明其作用机制假说。
- 筛选：提供快速、可重复的检测结果，用于评估样本的高凝状态。
- 分析：生成定量的凝固时间数据，支持不同条件间的比较及统计分析。
- 转化研究：通过与疾病相关的细胞外囊泡测量，将发现研究成果衔接至临床前模型。
- 企业级复用：提供可扩展、标准化的平台，支持跨适应症的持续性细胞外囊泡功能研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对细胞外囊泡相关凝血机制及靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：提供快速、标准化且可重复的床旁检测能力。
- 战略价值：通过在研发早期提供可操作的凝血风险数据，改善决策进程中的立项或终止决策。
- 项目组合影响：支持针对细胞外囊泡介导病理过程的项目进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备凝血生物学和细胞外囊泡（EV）分离技术方面的专业知识。
- 需要具备使用黏弹性分析仪以及标准化血浆制备方案的条件。
- 要求各团队在检测参数和数据分析标准方面达成一致。
- 可能需要根据不同的疾病模型或样本类型进行方法调整。
- 检测结果的可靠性依赖于EV富集与去除步骤的质量。
