基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

我们正在致力于加速基于生物标志物的发现。其中一个关键步骤是高效且选择性地分离这些生物标志物。基于Mag-Net EV分离技术的EV捕获方法能够显著帮助我们，它具有高通量、操作简便的优点，尤其适合临床应用。

我们一直采用该方案来发现不同疾病的蛋白质和磷酸化蛋白生物标志物，例如转移性癌症、肾癌和帕金森病。这些生物标志物来源于生物液体。细胞外囊泡（EVs）有望用于液体活检，从而进一步改善临床诊断和治疗。

目前，细胞外囊泡分离最常用的方法是超速离心法和沉淀法。然而，这些方法存在共沉淀污染物以及回收效率低等局限性。因此，我们的EV富集方法将为细胞外囊泡的分离提供一种更高效的技术路径，有助于实现更高重复性和更灵敏的检测，并有利于后续分析。

我们正在推进两项工作。首先，我们持续开发用于细胞外囊泡（EV）分离及下游分析的方法和实验方案，特别是基于质谱的分析。其次，由于EV检测技术的优势，我们正在探索其在临床领域的不同应用。

首先，从健康个体收集尿液样本。取12毫升样本置于15毫升锥形管中，离心以去除大凋亡体中的细胞碎片。然后，将上清液10毫升转移至新的15毫升离心管中。

向样品中加入1毫升上样缓冲液和200微升EV捕获珠悬浮液。将样品在室温下以翻转旋转方式孵育30分钟。为沉淀样品，将15毫升锥形管置于磁力分离架上。

小心移除上清液，并将磁珠重悬于1 mL洗涤缓冲液中。随后，将悬液转移至1.5 mL微量离心管中，轻轻吹打以重悬结合了细胞外囊泡（EV）的磁珠。将微量离心管置于适用于1.5 mL管的磁力分离架上。

使用P200移液器小心吸除上清液。随后，用1毫升洗涤缓冲液洗涤磁珠，再于室温下用1毫升PBS洗涤两次。将磁珠与100微升新配制的100毫摩尔三乙胺溶液在室温下孵育5分钟。

使用1.5毫升微量离心管磁性分离架收集含有细胞外囊泡（EVs）的洗脱液。合并洗脱液后，在4°C条件下使用真空离心浓缩仪将洗脱液干燥。首先，取通过EV trap方法从人尿液中获得的干燥细胞外囊泡样本。

使用所示组分配制新鲜的裂解缓冲液。然后，加入 100 微升裂解缓冲液以溶解干燥的 EV 样品。在 95 摄氏度下加热样品 10 分钟，同时以 1,100 转/分钟的速度振荡。

将样品冷却至室温后，加入 400 微升 50 毫摩尔 TEAB，稀释五倍。根据制造商说明书，使用 BCA 法蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。向样品中加入胰蛋白酶和赖氨酰内肽酶 C 混合液。

37摄氏度下振荡培养过夜，转速为1,100转/分钟。然后，向样品中加入50微升10%三氯乙酸或TFA以酸化样品。接着，向样品中加入600微升乙酸乙酯，并涡旋混合2分钟。

将样品在 20,000 G 条件下离心 3 分钟，小心移除上层液体，避免扰动界面。使用真空离心浓缩仪干燥水相。随后，将干燥后的样品重悬于 200 微升 0.1% TFA 中，以酸化肽段。

为去除样品中的盐分，使用C18脱盐小柱，先用200 µL含0.1% TFA的80%乙腈溶液进行预处理，随后用200 µL含0.1% TFA的溶液洗涤两次。将酸化后的肽样品加载至小柱中，并用200 µL含0.1% TFA的溶液洗涤三次。最后用200 µL含0.1% TFA和80%乙腈的溶液洗脱肽段。

按照演示方法吸取洗脱液后，将干燥的磷酸化蛋白质组样品重悬于200微升负载缓冲液中，用于磷酸化肽段富集。向样品中加入50微升磁珠，在室温下剧烈振荡20分钟。将含有磁珠的样品加入滤芯小柱中，在100 × g条件下离心1分钟。随后依次用200微升负载缓冲液、洗涤缓冲液一和洗涤缓冲液二洗涤小柱。

将含有珠子的枪头放入新离心管中，以收集洗脱的磷酸化肽段。向枪头中加入50微升洗脱缓冲液，并在20G条件下离心两分钟。

然后，使用真空离心浓缩仪干燥洗脱下来的磷酸化肽段。首先，利用EV trap方法分离尿液样本中的细胞外囊泡，并制备其蛋白质组和磷酸化蛋白质组样本。通过液相色谱系统将样本注入捕获离子淌度飞行时间质谱仪中。

将肽段分离至一根15厘米长的C18色谱柱中。进行蛋白质组学分析时，采用dia-PASEF方法采集数据，每阶质谱扫描范围为质荷比300至1200，离子淌度常数范围为0.6至1.501 K₀。进行磷酸化蛋白质组学分析时，采用dia-PASEF采集方法获取数据。

将每段质谱扫描的质量范围设置为质荷比400至1550，离子淌度常数设置为0.6至1.501每节。将原始文件载入蛋白质组学软件中。在智人（homo sapiens）数据库中设置搜索参数。

在消化类型中选择“特异性”，在酶选项中选择胰蛋白酶P。将肽段长度定义为最小7，最大52，并允许两个漏切位点。然后，将最大可变修饰数设置为5。固定修饰应为半胱氨酸上的羧氨甲基化。

可变修饰应包括：蛋白质及末端乙酰化、甲硫氨酸氧化，以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。最后，在液相色谱-质谱和质谱蛋白质组学分析中，将肽段-谱图匹配、肽段及蛋白质组的错误发现率设为 0.01。

每个样本的2%可检测到约2,200种蛋白质中的11,000多种独特肽段。值得注意的是，在三个重复样本中，72%的独特蛋白质均稳定存在，并且相较于ExoCarta数据库，共鉴定出90种主要的细胞外囊泡（EV）标志物蛋白。定量精度经验证，其低中等变异系数为5.7%，表明该方法具有高度的可重复性和可靠性。

在磷酸化蛋白质组学分析中，每个肽段样品有98%产生了800种独特的磷酸肽和350种磷酸化蛋白。富集结果表明，磷酸丝氨酸肽占72%，磷酸苏氨酸肽占22%，磷酸酪氨酸肽占6%。42%的磷酸肽在所有重复实验中均被鉴定到，且中等变异系数为21.8%，表明定量重复性良好。