多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

我们的研究重点是优化从临床来源获取的石蜡切片上的多重免疫组化（mIHC）实验方案。我们旨在有效解决肺组织中的自发荧光及荧光通道串扰问题。目前我们面临的实验挑战在于克服肺组织中超强荧光和通道间串扰的问题，从而实现对目标细胞和蛋白质标记所需的多色荧光定位。

我们高效且多重抗原同步分析的方法，每种抗体检测耗时不到三小时，可无缝整合多光谱显像系统与专用病理学软件。该优化的多重免疫组化（mIHC）方案易于在其他研究实验室中推广应用。首先，获取先前制备完成的配方以及固定并经石蜡包埋的肺癌组织样本切片。

在 65 摄氏度下孵育 5 分钟。将切片浸入二甲苯中进行脱蜡，随后依次浸入浓度递减的乙醇溶液中。然后将切片浸入无菌水中，每次 1 分钟，重复三次。

进行抗原修复时，将切片放入染色修复盒中，加入pH为6或9的免疫组化抗原修复缓冲液工作液，盖上盖子，在微波炉中以100%功率加热8分钟。

然后将玻片冷却至室温。用封闭液覆盖组织，随后在湿盒中室温孵育10分钟。去除封闭液后，加入一抗工作液覆盖玻片，并将其置于湿盒中。

然后，将此孵育室在37摄氏度下孵育1小时。接着，用洗涤缓冲液工作液洗涤玻片2分钟。直接将聚合物辣根过氧化物酶以滴加方式加入玻片，并在室温下孵育15分钟。

洗涤玻片后，直接将荧光染料工作液滴加到玻片上，室温孵育10分钟。玻片洗涤后，按先前所示方法进行微波处理。当玻片冷却至室温后，用双蒸水洗涤三次，每次一分钟。

接下来，将切片浸入洗涤缓冲液工作液中 2 分钟，然后按照所示进行抗体孵育、辣根过氧化物酶及荧光染料的添加。对于细胞核染色，用 DAPI 工作液覆盖切片，并在湿盒中室温孵育 5 分钟。随后，用双蒸水洗涤切片，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。

从载玻片上除去水滴。向载玻片加入10至20微升抗荧光淬灭剂，并用显微镜盖玻片封片。首先，获取先前制备好的经染色的肺癌组织样本载玻片。

对于染色切片的自动扫描，需为每个荧光通道手动设置曝光时间和扫描程序。将原始扫描获得的多色荧光图像文件拖入软件中，并将图像类型设置为荧光。单击亮度对比度按钮，并在面板上勾选相应的通道。

单击通道外部，然后单击目标通道以选择所需的荧光通道。拖动最小显示值和最大显示值，以调整每个通道的亮度和对比度。确定要保存的图像视图后，单击“显示载片概览”和“显示光标位置”以移除这两项内容，仅保留比例尺。

单击“文件”，然后选择“导出快照”和“当前查看器内容”，以导出 PNG 文件。非小细胞肺鳞状癌组织显示，巨噬细胞和 CD8 阳性 T 细胞在癌灶周围及内部显著浸润。HMGCS1 蛋白在鳞状癌细胞胞浆中呈广泛表达。