淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

淋巴瘤在组织学上属于复杂的肿瘤。因此，与传统的显色免疫组织化学相比，多重荧光免疫组织化学在研究肿瘤细胞及其微环境中目标标志物方面具有优势。该技术有望实现组织学淋巴瘤样本中基于抗体染色评分的标准化，而这一过程由于肿瘤微环境的复杂性，在过去一直具有挑战性。

具体而言，多重荧光免疫组织化学结合光谱成像技术可在单张切片上对多种染色进行定量测量，从而实现对临床样本中抗原共表达及空间关系的评估。首先，将脱蜡并复水的切片浸入标准抗原修复缓冲液中，置于微波炉安全的玻璃罐内，并在适当的微波炉中进行加热诱导的表位修复。根据抗体在最终多重染色序列中的位置，进行额外轮次的微波 stripping 处理。

例如，第四种抗体在染色前需要额外进行三轮微波剥离。完成剥离过程后，使用镊子和耐热手套将切片转移至室温蒸馏水中，冷却至少10分钟。当抗原修复液冷却后，用商用过氧化物酶阻断剂阻断组织中的过氧化物酶活性，作用10分钟，随后在Tris缓冲盐水（TBS）中加入非离子型去污剂洗涤5分钟。

用封闭缓冲液室温孵育10分钟，以阻断任何非特异性染色，随后加入目标一抗，室温孵育30分钟，并用TBS-D缓冲液洗涤三次，每次五分钟。接着，将样品与适当的辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育15分钟，然后如上所述用TBS-D缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，向切片加入适当的基于酪胺的荧光试剂，室温孵育五分钟，随后进行三次TBS-D缓冲液洗涤，每次五分钟。

按照所示方法，使用新鲜的抗原修复液进行额外的微波介导剥离，以去除一抗和二抗。修复结束后，将切片在蒸馏水中冷却，并用实验室擦拭纸擦干切片上无组织的区域。室温下用 dappy 孵育切片 10 分钟，随后进行三次 TBS-D 洗涤。

然后，使用实验室擦拭纸小心地将载玻片干燥，避免接触组织，并用适当的封片介质封片以进行成像。对于单plex载玻片扫描，根据用于标记样本的荧光染料选择相应的滤光片，并逐一检查每个标记物及其对应的荧光通道，以确定获得清晰信号的合适曝光时间，重点关注该标记物应呈现最强信号的组织成分。为了实现样本间的像素强度比较，使用实时相机模式调节每个独立通道的曝光时间，直至实时图像中无过曝区域。

扫描完所有切片后，获取模拟明场图像，以便与正常的免疫组化模式进行直观比较，并判断染色模式是否正确。扫描组织芯片切片时，使用成像系统中的组织芯片扫描模式及适当的自动对焦算法。对于完整的组织切片，应由合格的病理学家对切片进行评估，以从最具代表性的肿瘤区域中选择最适宜的图像。

开始分析前，选择一种肿瘤标志物以识别分析所需的感兴趣细胞。请病理学家审阅图像，并判断是否需要进行组织分割。如果需要，选择适当的对照区域进行分割，并检查图像分析软件能否正确识别这些区域。

完成细胞分割后，应由病理学家审查分割图，以确保所采用的分割方法准确可靠，并逐一检查图像，判断细胞分割是否充分，或是否需要进一步进行组织分割，以选择富含肿瘤细胞、间质和/或坏死区域的区域。随后，在病理学家的协助下确定每个标记物的光学强度阳性阈值，并使用适当的统计软件生成直方图，以分析每个细胞标记物强度的频率分布。为了获得特定标记物在定义细胞群体中的百分比数据，可在数据表中插入数据透视表，并选择“求和”以计算单个目标标记物的阳性百分比。

将计算标记阳性细胞总数占细胞总数的比例。该结果即为单个组织芯或单个研究编号的标记阳性细胞百分比。为了获得数值数据，需获取样本中所有细胞内各目标标记物的平均强度，以提取每个组织芯或研究编号中各标记物的中位数归一化计数。

此处展示了具有 c-MYC 和 BCL2 基因重排的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤样本的代表性多重荧光免疫组化图像。模拟的明场免疫组化图像显示出相似的肿瘤标志物染色模式。将多重荧光免疫组化技术应用于血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤的 T 细胞抗体组合，可揭示该肿瘤样本中的细胞异质性。

此处展示了扁桃体对照样本的优化过程及相应的数据分析结果。在完成光谱分离步骤后，可使用多种图像分析软件对肿瘤细胞及肿瘤微环境中的标志物表达水平和定位情况进行定量分析。该技术为研究人员在淋巴瘤单张组织切片中特定细胞类型内研究多种标志物的共表达提供了可行路径。

在进行微波处理步骤时，注意防止热损伤，并在甲板上进行扫描步骤时注意防滑倒风险。