调幅电变形法评估生物细胞的力学疲劳

我们的研究聚焦于循环细胞（如人类红细胞）的细胞生物力学。我们利用电动力学、微流控技术和材料科学，探究细胞膜损伤的力学成因，以及某些疾病中血细胞寿命缩短的潜在机制。生物细胞的疲劳研究具有挑战性。

该方法需要对细胞膜施加循环载荷，并追踪单个细胞的形变情况。通过使用幅移键控（amplitude-shift keying, ASK）来调制红细胞的电致变形行为，我们能够量化细胞变形能力的变化与加载周期之间的对应关系。我们首次证明，仅通过循环拉伸即可导致红细胞膜的降解。

本方案利用介电电泳将细胞移动至电极边缘，以进行电极形变测量。该方法无需任何稳定技术，可直接用于细胞悬液。采用叉指微电极可使我们在单个视野中同时测量数十个细胞。

为配制介电泳（DEP）介质，使用天平称取12.75克蔗糖和0.45克葡萄糖。将两种粉末溶解于150毫升去离子水与3.5毫升PBS的混合溶液中。使用低电导率测试仪测量溶液电导率，确保其为0.04西门子每米。

使用渗透压计确认渗透压处于血浆正常范围内。将配制好的 DEP 培养基在 4 摄氏度下保存。在 15 毫升离心管中，将 0.5 克牛血清白蛋白溶解于 10 毫升 DEP 培养基中，并使用涡旋振荡器充分混匀，以制备装置的预处理培养基。

首先，将用于微流控通道设计的SU-8模具硅片用胶带固定在直径14厘米的塑料培养皿内侧，并用氮气清洁。在纸杯中称取适量的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂和PDMS固化剂。使用木制刮刀将两者混合，直至混合物变为乳白色浑浊状。

将PDMS混合物倒入含有硅片的塑料培养皿中。然后将培养皿放入配备三通旋塞的真空干燥器中。旋转旋塞阀门，使真空与干燥室连通，以去除混合物中的气泡。

待通道结构中的所有气泡完全排出后，将培养皿置于70摄氏度的烘箱中加热四小时。待培养皿冷却至室温后，将其放置于切割垫上。使用手术刀，切下PDMS在硅片上方的相应部分。

将切割好的PDMS置于两层实验室包装膜之间。微通道凹槽与薄膜之间的间隙有助于定位微流控通道的入口和出口。接着，使用剃刀刀片从大块PDMS中切出单个通道。

使用相应的活检打孔器，在通道上制作合适的进样口和出样口。将整个打孔后的通道放置在干净的载玻片上，确保通道面朝上。将一块带有薄膜氧化铟锡（即 ITO）叉指电极的玻璃基底放在同一载玻片上，电极面朝上。

然后将载玻片轻轻放入等离子清洗机中。关闭气体阀门并启动真空泵，等待两分钟，使传感器读数达到 600 至 800 毫托。接着打开电源开关，等待 30 秒后，将射频功率旋钮从低调至高，并等待一分钟。

然后关闭设备时，需按照相反的顺序操作。在打开等离子清洗仪腔室后，立即提起PDMS并旋转180度，使带有微通道的一面朝下。将该面置于ITO基底上方，以启动键合过程。

使用镊子轻轻按压 PDMS 的四个角，持续约三秒钟。用 23 号针头将 1 毫升注射器吸取润洗液。将针头垂直插入入口孔中，缓慢而小心地注入润洗液以润湿通道，注意避免引入气泡。

孵育至少三分钟后，使用10微升移液枪头移除初代培养基。最后，通过将介电电泳培养基注入通道，重复洗涤三次。开始洗涤时，取20微升全血与1毫升PBS混合，在268×g条件下离心三分钟。

然后弃去上清液。用1 mL PBS通过轻柔吹打重悬所得的红细胞（RBCs）。再次洗涤RBCs，并如前所述弃去上清液。

使用10微升微量移液器吸头，吸取5微升红细胞沉淀，并将其完全排入1毫升介电电泳（DEP）培养基中。按照演示方法洗涤细胞，并弃去上清液。通过轻柔吹打，将沉淀的红细胞重悬于1毫升DEP培养基中。

洗涤细胞并弃去上清液后，用移液器将两微升红细胞沉淀加入500微升DEP培养基中。使用标准细胞计数板确认所得细胞悬液的浓度。首先，将微流控装置放入测试夹具的底部。

将夹具的上部对准设备，并使用两组尼龙螺丝和螺母将两部分组装在一起。将测试夹具放置在显微镜载物台上。在显微镜下找到一组所需电极，将与该电极组相对应的一对电极导线连接至函数发生器的输出端口。

从微流控通道的三毫米入口处移除五微升介电电泳（DEP）介质。使用10微升移液枪头，缓慢将五微升制备好的红细胞（RBC）悬液加入入口，静置细胞一分钟。在20倍放大倍数下观察通道。

按下正弦按钮，设置一个均方根幅度为两伏、频率为三兆赫兹的正弦波。按下调制按钮以启用调制功能。按下类型选项，将波形模式更改为幅移键控（ASK）。

将调制频率设置为250毫赫兹，对应四秒的加载/卸载周期。打开信号发生器的输出，每10分钟以每秒30帧的速度记录一段时长一分钟的视频。红细胞在电刺激下自发地向电场强度较高的电极边缘移动。

在通电相位下，红细胞因电致变形而被拉伸；而在断电相位下，红细胞则发生松弛。在持续一小时的疲劳测试中追踪单个红细胞时，可观察到细胞变形程度逐渐降低。