阿尔茨海默病（AD）神经模型中线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的定量分析

我们正试图定量测量不同厚度或间隙宽度的线粒体相关内质网膜的稳定性，这对于调控包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病的病理生理过程具有重要意义。近期关于线粒体相关内质网膜（常称为MAMs）的研究已将其描述为在AD早期阶段启动淀粉样蛋白病理的关键因素之一。这些发现催生了一种名为MAM假说的新理论，该假说认为AD完全是一种与MAM相关的疾病。

本方案首次提供了一种定量工具，用于在活细胞中测量线粒体-内质网接触（MAM）的稳定性，而这一目标迄今为止仍具挑战性。本方案最大的优势在于利用了线粒体固有的动态特性，能够在活细胞中通过调节MAM间隙宽度的松紧程度，定量检测MAM稳定性的变化。

在不久的将来，我们的重点是改进并应用先进的活细胞成像和显微追踪成像技术，利用近期开发的阿尔茨海默病药物筛选平台，筛选一系列经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的、针对线粒体相关内质网膜（MAM）或MAM结合型σ1受体的合成或天然小分子调节剂，并阐明其作用机制。

[旁白] 为了用MAM稳定剂转染细胞，将每个孔中的骨髓单个核细胞混合物替换为两毫升室温的DMEM-F12培养基。按照4.5:1的比例将核转染试剂与添加剂1混合。向混合物中加入100微升核转染试剂。然后涡旋DNA溶液。每种处理分别向独立的1毫升微量离心管中加入1至5微克DNA。吸除细胞中现有的培养基后，用10毫升PBS洗涤细胞一次。吸除PBS，然后直接向细胞中加入1毫升accutase。在37摄氏度下孵育5至10分钟。然后轻轻敲击培养皿侧面以使细胞脱落。在显微镜下确认细胞已松动并自由流动。用10毫升DMEM-F12培养基中和accutase，将细胞悬液转移至洁净的15毫升离心管中。接下来，取10微升悬浮细胞加入细胞计数板的A侧。然后将装填好的计数板A侧插入细胞计数仪前方的主插槽中。按下“测量”按钮并记录每毫升细胞数量。将所需数量的细胞在300 × g下离心5分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于每电穿孔样品100微升的核转染混合液中。接着，将100微升重悬的细胞悬液加入含有DNA的离心管之一。通过反复吹打混合溶液。然后将DNA-细胞混合物转移至电穿孔比色杯中，并用提供的盖子密封。在仪器上选择合适的核转染程序。立即使用无菌移液器从预装的六孔板中加入约500微升DMEM至比色杯中。轻轻混合一次，然后将电穿孔后的细胞和培养基转移至对应的孔中。开始时，将含有细胞的六孔板放入显微镜载物台腔室，调节显微镜焦距直至细胞可见。为捕获红色荧光蛋白信号，使用594纳米激光激发荧光染料，并将发射波长设置为570至640纳米。对于绿色荧光蛋白，使用488纳米激光激发，发射波长设置为510至540纳米。裁剪扫描区域以围绕轴突。较小的扫描区域将减少处理时间并简化动态线扫描（kymography）的生成。将时间间隔设为每秒一帧，总时长设为181秒。点击“运行”以启动过程。与游离型及MAM 9X结合的线粒体相比，MAM 1X标记的内质网结合线粒体的轴突运输速度降低了50%。MAM 1X线粒体中有26.6%具有移动性，而游离线粒体为53.82%，MAM 9X线粒体为44.79%。MAM 1X线粒体的逆向运动低于Mito-RFP线粒体和MAM 9X线粒体。MAM 1X线粒体的顺向运动也低于Mito-RFP线粒体。MAM 1X线粒体的静止比例显著高于MAM 9X线粒体，表明其运动能力下降，同时MAM 1X线粒体的整体运动速度也显著低于MAM 9X线粒体。