帕金森病模型中线粒体形态的组织学检查

本实验室研究帕金森病背景下与蛋白质聚集相关的细胞机制。此外，我们利用细胞和动物模型来测试针对帕金森病的潜在治疗方法。本文中，我们提出了一种基于免疫染色和石蜡包埋组织切片图像分析，原位研究线粒体形态以评估其健康状况的实验方案。

线粒体形态已在帕金森病及其他疾病的体外研究中得到广泛探讨。然而，目前仍缺乏在活体动物中研究线粒体形态的实验方案。本方案提供了一种在脑组织中稳定标记线粒体的可靠方法，并详细说明了如何进行形态学分析。

本研究表明，免疫染色结合图像分析是研究线粒体形态的可靠方法。该方法能够定量分析细胞培养物和组织中线粒体的数量以及其他形态学参数，例如长宽比。重要的是，由于该方法基于免疫荧光技术，因此可将形态学特征与特定的细胞群体关联起来。

本文介绍了一种用于研究帕金森病中线粒体形态的实验方案，但该方案也可应用于任何体内疾病模型。此外，该方法可能有助于筛选治疗帕金森病的先导化合物，同时也可用于其他以线粒体功能失调为特征的疾病的药物筛选。首先，取PFF注射的C57黑六小鼠的石蜡包埋脑切片。

将切片浸入二甲苯替代物中脱蜡，并孵育两分钟。随后进行水化：将切片依次浸入100%、95%和70%乙醇中，然后在去离子水中浸两次。将样本连同双蒸水一起转移至可微波加热的容器中。

将 pH 为 6 的 100 倍柠檬酸盐缓冲液在 4 摄氏度下预温。然后配制 350 毫升新鲜柠檬酸盐缓冲液。将配好的柠檬酸盐缓冲液倒入带盖的塑料容器中。

将切片放入柠檬酸盐缓冲液容器中并盖紧盖子。在700瓦下微波处理4分钟，然后静置5分钟。再以微波处理1.5分钟，随后再次静置5分钟，并补充柠檬酸盐缓冲液。

微波处理1.5分钟，静置5分钟。随后将样本和柠檬酸缓冲液置于冰上冷却20分钟，并用双蒸水洗涤。用纸巾轻轻吸干样本玻片，避免接触组织。

使用防脱液笔在组织块周围画出矩形。随后将所有载玻片转移至免疫染色盒中。用 TBS-T 轻柔地多次洗涤，确保 TBS-T 液滴保持在防脱液笔画出的矩形区域内。

用纸巾轻拍载玻片以去除 TBS-T。每个矩形区域加入 50 微升封闭液，在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，用纸巾将封闭液从样本上移除。

将50微升TBS-T中的初级抗体混合液轻轻吹打加入每个矩形区域，然后在4摄氏度下孵育样品过夜。随后用TBS-T洗涤切片，并通过轻拍纸巾去除TBS-T。

重复此步骤三次。接着，向每个矩形区域加入50 µL以TBS-T配制的1:1000稀释的二抗混合液，在37°C避光孵育1小时。随后，用TBS-T洗涤样本三次。

然后将样品与浓度为每毫升2微克的DAPI以及TBS-T孵育1分钟。用纸巾轻拍去除DAPI溶液，并用TBS-T洗涤3次。为固定盖玻片，向每张载玻片的样品上各加入两滴封片试剂。

轻轻按压盖玻片以去除气泡，并在室温下干燥样品1小时。使用配备60倍油镜的结构照明显微荧光成像系统或共聚焦技术，在多个视野中对至少50个细胞进行成像。分析细胞时，通过在阳性或阴性细胞周围绘制轮廓并使用裁剪功能，来分离感兴趣区域。

接下来，激活形状描述符，并在“设置测量”功能中限制为阈值选项。通过在“调整”菜单中选择阈值功能来调节阈值水平。最后，使用“分析颗粒”工具并设置合适的尺寸范围以识别线粒体。

例如，将尺寸设置为 25 无穷大，然后激活像素单位并选择显示掩膜。图中显示了注射 PFF 的小鼠的黑质致密部，共免疫标记了酪氨酸羟化酶、VDAC1、PS129 α-突触核蛋白和 DAPI。抗 PS129 α-突触核蛋白染色可区分携带 PS129 病变的细胞与健康细胞。

对酪氨酸羟化酶阳性神经元中VDAC1染色的图像分析显示，携带PS129病变的神经元与不携带该病变的神经元相比，线粒体数量计数和长宽比均有所减少。