大鼠来源脱细胞脾脏基质的制备

我们提出一种常规策略，该策略涉及利用脱细胞脾脏基质的尺寸以及按人工层级设计的替代支架，详细展示了获取红色脾脏、制备脱细胞脾脏基质的过程，该基质可保留大体结构及细胞外基质的组分。本方案可提供一种易于获取的脾脏基质尺寸，作为扩大供体来源的替代方案。本方案所提出的方法在制备脱细胞脾脏基质方面表现出高效性、稳定性以及最小侵入性。

该方法可保持脾脏固有的结构组成和天然血管网络，提供支架、完整的细胞植入以及三维动态培养，从而为组织工程肝脏的研究进展奠定基础。首先，将一只麻醉并剃毛的大鼠仰卧位固定于手术台上。

向阴茎背静脉注入2毫升肝素化生理盐水，以实现全身抗凝。使用聚维酮碘溶液对剃毛后的腹部皮肤进行消毒，并覆盖无菌铺巾。使用手术剪在腹部做十字形切口。

用止血钳撑开腹腔，将肝脏翻向膈肌。将胃肠道外置于腹部右侧，并用湿润纱布覆盖。仔细分离并剪开脾胃韧带，以暴露脾门。

沿脾门逐步解剖，分离并暴露肝总动脉、胃十二指肠动脉和脾动脉。结扎并切断胃十二指肠动脉和肝总动脉，同时逐步游离周围组织。将脾脏向右侧翻转，以暴露腹主动脉。

使用棉签轻轻进行钝性分离，暴露腹主动脉和腹腔干。在腹腔干分支的上方和下方约三厘米处，各放置一根长度约为三厘米的3-0丝线。然后，在腹腔干分支处放置一根长10厘米的6-0丝线。

在腹腔干分支的上方和下方结扎腹主动脉。然后，在动脉分支处做一个小切口。轻轻提起6-0丝线，沿腹腔干将24号静脉导管插入脾动脉。

结扎导管以固定其位置。使用注射泵以每分钟 4 毫升的速度注入 50 毫升含肝素的生理盐水。同时切断门静脉作为流出道，使灌注液体能够从脾脏流出。

仔细解剖脾脏周围组织，避免损伤胰腺，同时保留主要的副血管。检查脾脏周围是否有渗漏。随后，取出脾脏和胰腺，并用生理盐水冲洗。

将脾脏转移至含有生理盐水的50毫升离心管中，并储存在-80摄氏度的冰箱中。首先，将冷冻的大鼠脾脏反复冻融三次，以裂解脾细胞。

在洁净的工作台上，安装蠕动泵、两升储液罐、内径为 2.4 毫米的硅胶管和气泡捕集器。用去离子水填充灌注系统，并持续运行 10 分钟。

将收获的脾脏小心转移至盛有去离子水的容器中。接着，将硅胶管连接至已插入脾动脉的静脉导管。依次用去离子水、0.1% SDS、1% Triton X-100 和 PBS 溶液进行灌注。

用含有10%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）填充一个50毫升离心管。将脱细胞脾脏基质转移至PBS中，于-20°C保存，直至后续实验使用。

脾脏的完全脱细胞化过程大约在11小时内完成。颜色逐渐由深红色转变为浅红色，最终呈现白色半透明外观，整体形态保持完整。