利用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估

我们正在设计一种检测方法，用于在生理条件下评估血小板功能，通过在具有膜容量传感器的半刚性微环境中激活血小板，以克服现有检测方法的局限性。该检测方法可测量血小板计数、刺激强度以及激活通路。此工具为研究止血过程中的血小板机制提供了全面的方法。

我们的方案可在生理条件下通过单次检测评估血小板的多个参数。我们将致力于优化该方案，并开发其他止血评估传感器。首先，使用标准的CAD布局软件设计团队膜电容芯片（MCC）的布局，用于四英寸硅片基底的微加工工艺，具体步骤如论文中所述。

进行生物功能化时，使用氧气等离子体在100瓦功率下处理TMCC的传感电极45秒以进行清洁。将一份十二醛的200 proof乙醇溶液加入TMCC的样品孔中。将TMCC置于充满干燥氮气的容器中。

将容器密封，并用封口膜包裹，静置 24 至 48 小时。两天后，用去离子水和 200 proof 乙醇冲洗 TMCC 的金表面。在室温下用氮气吹干 TMCC。

将 PBS 中的人纤维连接蛋白溶液加入 TMCC 的样品孔中，在 37 摄氏度孵育 2 至 8 小时。对于电容传感器的设置，使用配备微调定位装置和针状探针的 LCR 表与传感器建立电接触。采用 3D 打印的塑料夹具，以牢固放置 TMCC 和 BMCC。

确保底部夹具在 XY 轴上装有止动器，以将 TMCC 精确定位在 BMCC 上方，形成电容器。施加 0.5 伏特、100 千赫兹的正弦信号，采样率为 8 赫兹。为获得浓缩血小板血浆（CPRP），对人血液样本进行离心处理。

将CPRP转移至无菌容器中，并进行血小板计数。对于抑制剂研究，将CPRP与特定制浓度的阿司匹林在Tyrode缓冲液中孵育。对于血小板功能检测，将TMCC和BMCC组装至3D打印的固定装置中。

测量组装好的MCCs的基线电容5分钟，然后向TMCC的样品孔中加入45微升CPRP，并等待30分钟，使血小板在TMCC中黏附于纤维连接蛋白包被的电极上。接着，在不扰动已黏附血小板的情况下，从样品孔中移除30微升CPRP，并用Tyrode's缓冲液重新填充孔内液体。最后一次洗涤后，加入10微升所需浓度的激动剂溶液，并使样品平衡80分钟。

测量细胞贴附30分钟后电容的最大变化值，以确定贴附阶段的电容变化量（delta C adhesion）。在激活阶段，测量电容的最大变化值，称为激活阶段电容变化量（delta C activation）。计算激活后200至300秒间电容曲线的斜率，以确定激活阶段斜率（S activation）。

使用方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验进行组间结果比较的统计分析。采用Shapiro-Wilk拟合优度检验评估数据是否符合正态分布。含有预定血小板计数的CPRP溶液在黏附过程中表现出电容的线性下降。

凝血酶激活后观察到呈指数稳态下降。在不同血小板计数范围内，Delta C 黏附值与血小板计数表现出强相关性，在 1.3 毫摩尔阿司匹林浓度下显著降低。血小板刺激后电容的指数下降速率随细胞浓度增加而升高。

电容损失的幅度也随浓度升高而增大，delta C 激活呈现明显的上升趋势。S 激活和血小板计数也观察到类似趋势。随着阿司匹林剂量的增加，电容、delta C 激活和 S 激活均呈现下降趋势。

高剂量与中剂量之间S激活的差异具有统计学显著性，而delta C激活在两者之间未发现显著差异。使用凝血酶激活的CPRP样本的电容信号显示，随着凝血酶浓度的增加，电容降低更加明显。delta C激活和S激活均随凝血酶水平呈现出具有统计学显著性的趋势。