基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

我们研究的范围是表征人类细胞中不稳定致病性重复序列的DNA复制过程。我们希望回答以下问题：哪些特定的重复序列会导致复制叉停滞？这些重复序列会形成哪些独特的二级结构？

那么这些重复序列在 DNA 复制过程中是如何扩增的呢？尽管我们已知许多这类可形成结构的重复序列会阻碍 DNA 复制，但接下来具体发生的步骤仍不清楚。我们希望本实验方案有助于回答这一问题，并阐明这些致病性重复序列扩增的分子机制。

二维凝胶电泳提供了一个独特的机会，能够直观地观察在DNA复制过程中可能产生的分子相对群体的结构。通过一次实验，你基本上就可以获得特定DNA序列中复制进程的完整图谱。首先，将制备凝胶电泳所需的试剂放置在工作平台上。

将Tris-硼酸-EDTA（TBE）加入琼脂糖中，并在微波炉中加热溶液。然后将0.4%至0.5%的琼脂糖倒入制胶板中，制备第一维琼脂糖凝胶，并静置一小时使其凝固。凝固后，在凝胶最左侧边缘起始的前三厘米范围内加入DNA标准品。

然后加入用限制性内切酶消化的DNA样本，确保每对样本之间相距三厘米。在TBE缓冲液中以每厘米0.85伏的电压电泳19至24小时，按大小分离中间产物。次日，将凝胶从缓冲液中取出。

切下含有DNA标记物的前3厘米凝胶。将凝胶片段置于含有0.3微克/毫升溴化乙锭的TBE缓冲液中染色10至15分钟。然后使用凝胶成像系统观察DNA标记物。

在琼脂糖凝胶上，将估计位置增加1.3厘米，得到数值A；然后从数值A中减去7.5厘米，得到数值B。将尺子对准第一维凝胶，分别在数值A和B处水平切割。接着在每个样品预留的3厘米空间内垂直向下切割。在新的制胶托盘中，将凝胶片段顺时针旋转后放入样品加样孔的位置。配制第二维琼脂糖凝胶，浓度为1%至1.3%，溶于TBE缓冲液中，并加入0.3 µg/mL溴化乙锭。

加热凝胶，冷却至约 55 摄氏度后，将其倒入旋转的第一维胶段上。让凝胶凝固一小时。凝固后，将凝胶转移至含有含 0.3 微克/毫升溴化乙锭的 TBE 缓冲液的容器中，平衡 30 分钟。

盖上凝胶，在4°C条件下，以每厘米4.23伏的电压电泳9至10小时。从电泳槽中取出第二向凝胶，并在0.24摩尔盐酸溶液中轻轻振荡孵育10分钟，使DNA片段脱嘌呤。

用去离子水冲洗凝胶，并将其浸泡在 0.4 摩尔氢氧化钠溶液中 10 至 15 分钟。然后将两张长条形的层析滤纸垂直折叠在玻璃板上，使其延伸至容器中。为组装 Southern 印迹，向容器中加入一升 0.4 摩尔氢氧化钠溶液。

将一块长玻璃片横放在容器上。用氢氧化钠润湿滤纸的顶部，并小心去除其表面下的任何气泡。用氢氧化钠浸泡三张层析滤纸，然后将它们铺在已折叠的滤纸上。

去除所有气泡。将第二向凝胶倒置，放置在层析滤纸上。用去离子水润湿一张带正电荷的尼龙膜，然后将其覆盖在凝胶上。

然后将三张用去离子水浸湿的层析滤纸覆盖在膜上。用塑料膜盖住容器中任何暴露的氢氧化钠，以防止蒸发。在印迹上放置一叠高度为0.3至0.5米的餐巾纸或纸巾。

用重物压紧整个印迹，以促进紧密的毛细作用，并静置两天以完成DNA向膜的转移。