紫外线诱导的复制中间体的可视化 E. coli 使用二维琼脂糖凝胶分析

本实验的总体目标是利用二维凝胶分析技术，观察当DNA复制遇到DNA损伤时所产生的DNA结构中间体。首先从已诱导产生复制阻断性损伤的活跃分裂细胞中分离DNA，然后通过凝胶电泳根据回收DNA的大小进行分离，从而实现该目标。

接下来，将切下的胶条水平嵌入第二块凝胶中进行再次电泳，该电泳根据DNA的大小和形状进一步分离DNA。最后，通过Southern杂交分析来观察在紫外线诱导损伤发生前以及损伤发生后不同时间点与复制中DNA片段相关的DNA结构。最终，该实验流程可用于证明某些突变体无法处理DNA损伤，从而导致DNA修复中间产物的积累。

大家好，我叫Arthur Ian，来自波特兰州立大学的Corella实验室。大家好，我叫Brand she，我也来自Corella实验室。

今天我们将向您展示一种二维凝胶电泳的实验方法。我们在实验室中使用该方法来研究DNA复制和修复的中间产物。现在让我们开始吧。

开始此实验步骤时，将含有质粒PBR 322的200微升大肠杆菌（E. coli）过夜培养物接种于DGC大腿培养基中，加入氨苄青霉素，在37摄氏度条件下培养。使用DGC大腿培养基可最大限度减少紫外线屏蔽效应。过夜培养后，在14,000 RRP M条件下离心30秒，收集菌体沉淀。

然后将细胞沉淀重悬于200微升不含氨苄青霉素的DG C th培养基中，并接种至20毫升不含氨苄青霉素的DG C thigh培养基中，在37摄氏度摇床培养箱中培养至OD600为0.5，相当于约5×10⁸个细胞/毫升。在无氨苄青霉素条件下培养可避免对某些突变体中可能出现的异常或无功能复制中间体产生选择压力。

此外，如果使用紫外光诱导损伤，必须从培养基中去除氨苄青霉素，因为它在这些波长下具有强吸收，会起到屏蔽作用，从而在细胞生长过程中降低紫外光的有效剂量。使用UVC光度计确定距离15瓦杀菌灯多远的位置，可产生约每平方米每秒一焦耳（JUUL）的照射速率。

后续步骤应在黄光下进行，以防止紫外线照射后光裂合酶介导的环丁烷嘧啶二聚体发生光复活逆转。当细胞密度达到预期值时，使用移液器将培养物转移至置于旋转平台上的直径15厘米的培养皿中，以确保整个细胞群体受照均匀。接着，以50焦耳/平方米的剂量照射培养物，随后立即将其转移至无菌的预热烧瓶中，并放回37°C摇床培养箱中继续培养。

在整个实验过程中，该剂量平均每次检测时间点在每4.5 kb单链DNA中产生一个环丁烷嘧啶二聚体。将0.75 mL培养物移入含有0.75 mL冰冻NET 30缓冲液的管中。NET 30缓冲液作为终止缓冲液，可阻止复制和核苷酸切除修复的进行。

加入终止缓冲液后，样品可在冰上保存至时间过程结束。时间过程结束后，离心收集各样品并重悬沉淀。在150微升裂解缓冲液中，于37摄氏度孵育20分钟以裂解细胞，期间不进行震荡。

由于具有单链区域或分支点的复制结构更容易受到剪切力的影响，因此需使用剃刀片将移液管尖端切去，使管口变宽，以尽量减少剪切力。通常情况下，在裂解后应尽量减少移液和震荡操作，直至DNA经限制性内切酶消化完成。裂解后加入蛋白酶K和沙卡氏细胞，并继续孵育一小时，以释放与蛋白质结合的DNA片段。

由于活跃复制的DNA通常与蛋白质或膜复合物结合，这有助于提高复制片段的得率。一小时后，向每个样品中加入两倍体积的酚，轻轻颠倒试管五分钟，进行样品提取。然后加入两倍体积的氯仿、异戊醇和乙醇，再次轻轻颠倒试管，继续振荡五分钟。

接下来，在微量离心机中以14,000 RPM离心样品5分钟，并将每个样品的上层水相转移至新的离心管中。然后加入四倍体积的氯仿-异戊醇，再次轻轻颠倒混匀管子5分钟。随后再次以14,000 RPM离心5分钟。

将透析膜置于盛有250毫升0.1 xte的烧杯顶部，取每种样品100微升点样到透析膜上。透析完成后，让样品透析1小时。将每种样品80微升加入含有20微升酶混合液的新的1.5毫升离心管中。

在37摄氏度下过夜消化样品。PV two在复制起点的下游将质粒线性化。在上样琼脂糖凝胶之前，加入100微升氯仿和20微升含有溴酚蓝的6×上样缓冲液。

向每个样品中加入酚蓝和二甲苯青，混匀，氯仿将去除任何仍与DNA末端结合的PV2。通过在第一维中电泳已酶切的DNA样品，开始二维琼脂糖凝胶分析。首先将λ Hind III DNA大小标记物加入已制备好的0.4%琼脂糖凝胶（1×TBE缓冲液）的第一泳道中。

然后，每份样品加入40微升含有上样染料的水相，上样时跳过泳道以便于后续切胶。电泳完成后，以每厘米1伏的电压进行第一维电泳，时间约为12至15小时。低电压和低浓度琼脂糖凝胶主要用于根据DNA片段的大小进行分离。

第一维电泳结束后，使用大型切片刀切下含有λ-Hind III标记物的第一条泳道，并用溴化乙锭染色。进行第二维电泳时，以λ-Hind III标记物为参照，用大型切片刀将凝胶泳道切成条状，弃去每条泳道中预计线性化质粒迁移位置以下的区域。制备第二维凝胶时，将每条凝胶切片水平放置在空的凝胶制胶板顶部。

配制1% AROS的一倍XTBE溶液，并冷却至55摄氏度。待冷却后，倒入凝胶溶液以制备第二维凝胶，确保完全覆盖凝胶切片。在倒入凝胶前，必须确保切片排列均匀且凝胶模具水平。

凝胶完全凝固后，在允许缓冲液循环的电泳装置中，以每厘米6.5伏的电压进行第二向电泳，运行时间为五个半小时至七小时。高电压和高浓度琼脂糖凝胶能有效根据DNA片段的大小和构型进行分离。非线性构型的DNA片段在第二向电泳中的迁移速度较慢。电泳结束后，先用蒸馏水冲洗凝胶一次，然后在400毫升0.25摩尔盐酸溶液中轻轻振荡洗涤两次，每次15分钟。

酸洗的目的是将DNA分子部分切割成较小的片段，以便在Southern分析过程中更高效地转移，这对于分子量较大且形状特殊的DNA复制中间体而言是必要的。为准备凝胶进行碱性转移，需再次用清水冲洗凝胶，然后将其在400毫升0.4摩尔氢氧化钠溶液中洗涤两次，每次30分钟。随后，使用下压式碱性转移系统将凝胶中的DNA转移至高结合力N+尼龙膜上，转移液为0.4摩尔氢氧化钠，具体操作如本实验方案文字部分所述。DNA转移时间应为6至12小时。完成DNA转移后，按照书面实验方案中所述步骤继续进行探针杂交。

膜经过探针杂交并洗脱后，将膜置于一张纸巾上，直至液体明显消失。随后用聚氯乙烯塑料膜包裹膜，并使其接触磷屏成像仪的成像屏。最后，使用Storm 840成像仪及其配套的ImageQuant软件对放射性信号进行可视化和定量分析。

通过二维琼脂糖凝胶分析观察到PV两次消化PBR322质粒的迁移模式示意图。非复制型线性质粒以4.4 KB线性片段的形式迁移，而复制型质粒则形成Y形结构，由于其尺寸更大且呈非线性结构，迁移速度较非复制片段更慢。该迁移模式形成一条弧线，从线性区域向外延伸至加样孔方向，此现象在紫外照射后出现。

在锥形区域观察到双Y形或X形分子，其迁移速度比Y形分子的弧线更慢。图中展示了使用P32标记的PBR322探针对二维凝胶进行Southern分析的示例，分别显示细胞在紫外线照射后立即取样以及照射后15分钟取样的结果。当细胞在辐射后处于快速指数生长期时，总质粒DNA中约有1%存在于Y形弧线上。

随着受阻的复制叉在损伤位点处累积，可观察到Y形和S形分子的短暂增加。L形复制中间体也会短暂累积，并持续存在，直至与损伤被修复的时间点相对应。我们刚刚向您展示了如何利用二维凝胶电泳来可视化DNA修复中间体。

进行此操作时，需注意可能降低得率的剪切力，并对所有样品和凝胶轻柔操作。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。