肝细胞癌中系统性与局部免疫应答的质量细胞术分析

质谱流式细胞术使我们能够分析肝细胞癌中的系统性和局部免疫应答。通过在单细胞水平上对免疫细胞进行图谱分析，我们可识别与肿瘤进展相关的独特细胞亚群及其功能状态，从而揭示免疫逃逸机制，并为个体化治疗提供潜在的治疗靶点。本方案采用质谱流式细胞术在单细胞水平上同时分析超过14种标志物，避免了传统流式细胞术中存在的光谱重叠问题。该方法可精确识别真实的细胞群体，并提供高维数据，用于深入的免疫图谱绘制和生物标志物发现。

[旁白] 首先，解冻冻存的外周血单个核细胞和肝癌细胞悬液。细胞复苏后，将细胞重悬于1毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中。加入顺铂至终浓度为0.5微摩尔（μM），充分混匀，并在室温下孵育2分钟。为终止反应，将离心管在室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，然后向每管中加入1毫升细胞染色缓冲液。再次离心后，小心弃去上清液。为进行Fc受体阻断，首先为每个样本配制50微升（μL）阻断液：将48微升细胞染色缓冲液与2微升Fc阻断液混合。将细胞沉淀重悬于阻断液中，并进行孵育。接下来，为每个样本在标记好的离心管中加入1.1微升每种抗体，以配制膜蛋白抗体混合液。用细胞染色缓冲液补足体积至55微升。将50微升配制好的抗体混合液转移至每个样本管中，使总体积达到100微升。然后轻轻涡旋混匀样本，于室温孵育15分钟。向每个样本管中加入1毫升细胞染色缓冲液。在室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。最后一次洗涤后，用剩余液体与细胞沉淀短暂涡旋，以充分重悬细胞。对于核蛋白染色，向重悬的细胞中加入500微升固定液混合物。轻轻混匀样本，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，在室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。接着，向每管中加入1000微升破膜缓冲液以洗涤细胞。然后在室温下以1000 × g离心5分钟。弃去上清液后，向每管中加入50微升抗体混合液。轻轻吹打混匀细胞，充分混匀后进行孵育。接下来，向每管中加入1000微升破膜缓冲液，再次离心后弃去上清液。为固定细胞，向每个样本管中加入1毫升用PBS配制的1.6%甲醛溶液，并涡旋以充分混匀内容物。室温孵育10分钟后，离心样本并弃去上清液。对于核嵌入染色，首先用固定和破膜缓冲液稀释Cell-ID Intercalator Iridium。向每个样本中加入1毫升嵌入染色液。轻轻混匀并涡旋。将样本置于4°C过夜，然后按前述方法离心。孵育完成后，向离心管中加入1000微升细胞染色缓冲液。以800 × g离心5分钟，弃去上清液。最后，将细胞重悬于450至900微升去离子水中。在进一步分析前，用台盼蓝染色进行细胞计数。首先，开启质谱流式细胞仪并启动程序。在CyTOF系统中分析样本，获取外周血单个核细胞和肝癌细胞样本的质谱流式数据。在仪器上启动数据处理软件，对FCS文件中的CD45+细胞群进行预处理。然后利用活力染色（如顺铂排除法）去除死细胞。圈选CD45+细胞群以聚焦于免疫细胞，并导出该门控细胞群用于进一步分析。使用5作为协因子对数据进行转换。接下来，启动聚类软件，基于SPADE算法识别主要细胞簇，将具有相似标志物表达谱的细胞归为同一簇。应用分层随机邻域嵌入（HSNE）进行降维并识别不同细胞簇。然后使用软件中的CyTOF工具包对主要细胞簇进行再聚类。使用PhenoGraph程序在默认参数下识别亚簇。在外周血单个核细胞样本中总共鉴定出14种不同的细胞类型。每种14种细胞类型的标志物表达模式在热图中详细展示，显示出不同细胞群独特的表达谱。这些细胞类型的分布因样本而异：样本D中CD4+ T细胞比例较高，样本A和B中B细胞显著富集，而CD141+传统树突状细胞主要存在于样本C中。在组织样本中鉴定出8种细胞类型，包括单核细胞、T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜酸性粒细胞和髓系树突状细胞。组织细胞类型的标志物表达谱显示每种细胞群具有不同的表达模式。所有患者组织样本中细胞类型的比例保持一致，反映出肝细胞癌共有的免疫学特征。