肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布具有临床价值。该策略可轻松用于可视化、定量和绘制肿瘤组织内免疫细胞的分布图。免疫治疗已彻底改变了癌症治疗方式。

然而，并非所有患者都能产生良好应答。该策略可用于定义能够预测良好抗肿瘤反应的组织-免疫特征。在开展实验之前，应在对照组织上测试抗体组合及 stripping 技术，并验证 APPs 在检测目标标志物时的准确性。

由于图像分析方法的文字描述通常使用复杂的术语，将文字与视频相结合有助于更好地理解并复制该方法。对于福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片的抗原修复，需将脱蜡后的组织样本浸入盛有抗原修复液的Coplin瓶中，并将该瓶置于装有自来水的电压力锅内。水位不应超过瓶子高度的一半，以防止水与抗原修复液混合。

关闭压力锅的盖子和压力阀，对切片进行高压处理10分钟。处理结束后，拔掉电源，释放压力，然后打开盖子。切片在压力锅中冷却30分钟后，将样本转移至新的考普兰染色缸中，用新鲜的PBS溶液洗涤两次，每次五分钟。随后使用疏水笔在每张组织切片周围画出隔离屏障。

接下来，将切片浸入含0.1摩尔甘氨酸的PBS溶液中，室温孵育15分钟，然后按所示方法用PBS冲洗切片两次。第二次洗涤后，将切片转移至湿盒中，并用封闭液覆盖每张组织切片。室温孵育30分钟后，用新鲜的PBS-Tween溶液冲洗切片两次，每次5分钟，随后在避光条件下向每张切片加入用封闭液稀释的特异性一抗。

孵育结束后，用新鲜的PBS-Tween溶液将切片冲洗三次，每次五分钟，然后在室温下用相应的二抗孵育切片一小时。孵育结束后，再次用新鲜的PBS-Tween溶液将切片冲洗三次，每次五分钟，随后用双蒸水冲洗一次。

吸去每张切片上的多余水分，使用含DAPI的封片剂和盖玻片对组织进行封片。挤去多余的封片剂后，将切片置于室温避光条件下干燥20分钟，然后使用全片扫描仪采集所有通道的图像。扫描完成后，在图像分析软件中打开图像，点击Tissuealign标签页。

要将待对齐的图像导入到幻灯片托盘中，请从数据库中选择第一张待对齐的图像。当所有图像加载完成后，单击工作流程步骤中的“下一步”以链接图像，并将所有待对齐的图像拖放至第一张图像上。当所有图像均已正确链接后，每张图像至少使用三个标记点，指示链接图像中的同源组织特征。

使用针来追踪第一幅图像，以检查所得配准的质量。如果已获得满意的配准效果，单击“下一步”以查看图像层并将合成图像保存到数据库中。要使用用户自定义的协议 APP 1 进行组织检测，请打开“图像分析”选项卡，并在图像分析模块中打开合成图像。

点击“打开应用程序”图标，并选择合适的应用程序。为确认应用程序正常工作，请导航至选定的组织位置并点击“预览”。如果结果令人满意，请点击以使用选定的应用程序处理图像。

在处理过程中，应用程序将判断像素是否与组织相关，从而将所有与组织相关的像素转换为感兴趣区域。新创建的感兴趣区域可被转移至任意一幅已配准的图像中。分析结束后，单击“文件”并选择“保存”，以保存包含新创建感兴趣区域的修改后图像。

为了将组织分割为间质和实质，打开图像分析选项卡，并从数据库中选择感兴趣的文件。打开APP 2，APP 2利用PSR染色图像进行组织分割。通过在选定的视野中处理图像来预览APP 2。

如果结果满意，单击“运行”以在整幅图像上处理 APP 2。组织的兴趣区域将被分割为间质和实质，并确定各自的面积。新创建的间质和实质兴趣区域可转移至配准后的图像，然后按演示方法导出并保存修改后的图像。

为了识别并定量目标细胞群体，将目标分割图像导入图像分析模块。调整颜色后，打开 APP 3。APP 3 将在实质和间质中检测目标细胞群体并对其进行定量。

如果结果满意，则在整张图像上运行 APP 3。所有目标单个细胞将被标记，其组织坐标将被保存，并确定间质和实质区域中目标细胞的密度。随后可按照演示方法保存修改后的图像。

为了对标记的目标细胞进行组织热图分析，请在APP选择窗口中打开相应的用户自定义协议，然后点击“运行”，以提示APP利用抗体标记目标的坐标生成热图。热点区域以红色突出显示，表示目标细胞群体密度最高，而深蓝色区域则表示密度最低。特定细胞群体的热图可叠加到配准后的图像上，以提供有关这些细胞在肿瘤微环境中的空间分布情况的额外信息。

然后导出并保存组织热图。必须验证标记的特异性、所设计的APPs的准确性，以及在同一组织切片上不同染色的剥离和重新探针检测效率。通过整合连续成像、顺序标记和组织对齐，可以在有限的临床样本中同时可视化更多标志物，并提取更丰富的信息。

对切除的肿瘤组织切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，可评估组织结构、细胞形态以及临床相关参数，如恶性肿瘤类型、肿瘤分级和整体免疫细胞浸润情况。CD34染色可用于检测内皮细胞。细胞角蛋白8/18染色可显示上皮细胞的存在，而抗α-平滑肌肌动蛋白染色则可用于鉴定成纤维性活化的肝星状细胞。

使用抗 CD68 和抗结蛋白（Desmin）抗体进行复染，可分别检测巨噬细胞和肌成纤维细胞。为了更全面地表征肿瘤免疫浸润情况，可进行T细胞标记物和髓过氧化物酶的染色。此外，还可进行天狼星红（Picro Sirius Red）染色以显示纤维状胶原，有助于间质与实质的分割。

通过识别染色切片中与组织相关的像素，可实现对特定感兴趣区域内不同区室的分割。随后可在每个区域内识别出目标细胞群体，从而生成组织图谱，其中特定细胞群体密度较高的区域以热点显示，密度相对较低的区域则以冷点显示。这种用于在组织样本中识别、定量和定位免疫细胞的方法可根据具体的研究问题和目标标志物进行调整和验证。

该策略可应用于组织微阵列，以进行高通量分析。也可与原位杂交结合，同时检测原位蛋白质和基因表达。我们已采用该策略在肝纤维化患者肝组织中原位鉴定并定位产生IL-17A的细胞。

如实验方案所述，多种试剂具有化学危险性，相关操作应在化学通风橱中进行，并使用适当的个人防护装备和采取必要的预防措施。