冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期

我的研究聚焦于耳蜗的神经发育。具体而言，我旨在揭示耳蜗内SNAPS结构形成的潜在机制，并探究阿尔茨海默病与听力损失之间的关联。活体成像技术和遗传工具的进步使我们能够更详细地研究耳蜗结构和神经回路，从而更深入地理解听觉系统的韧性与功能障碍。通过发表本实验方案，我们希望帮助刚进入听觉科学研究领域的研究人员，尤其是那些此前未接触过耳蜗研究的学者。本指南逐步讲解了如何从胚胎期、新生期及成年小鼠中制备内耳样本。我们的目标是简化内耳实验操作，并确保实验结果的可靠性与可重复性。与全耳蜗铺片免疫染色等其他方法相比，切片免疫染色具有多项优势：它能良好地保存蛋白质和核酸，产生薄而近乎二维的切片，使测量结果更加准确和一致。该方法还能完整保留并清晰显示所有耳蜗细胞类型，提升免疫染色的效果。与铺片制备不同，切片技术可有效保存螺旋韧带、血管纹、前庭膜和盖膜等重要结构。

[Instructor] 首先，将已处死的幼年小鼠置于手术平台上。使用精细解剖剪，从颈部开始沿头皮正中线向吻部方向小心地做一纵行切口。接着，将剪刀的下刃置于枕骨大孔处，上刃置于颅骨顶部，沿颅骨上半部分剪至鼻部，完成第二次切割。将剪刀从部分切开的头部退出。再将剪刀的下刃置于颅骨底部，上刃置于枕骨大孔处，沿头部下半部分正中线剪至鼻部，完成第三次切割。使用精细镊子和剪刀，小心分离颞骨周围的所有软组织，包括脑组织、肌肉和结缔组织。随后，将小鼠的半侧头部放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板的孔中。用4%多聚甲醛溶液替换PBS进行固定，在室温下孵育45分钟。固定后，用PBS冲洗组织三次，每次5至10分钟。在小鼠半侧头部中定位颞骨或内耳囊。使用精细镊子，小心去除内耳囊周围的软组织。待松动后，剪开内耳囊周围的组织，然后用镊子轻轻按压内耳囊周围区域，使其完全游离。将分离出的内耳样本保存在4°C的PBS中。 首先，将已处死的成年小鼠置于手术平台上。使用锋利的解剖剪，从颈部开始沿头皮正中线向吻部方向做一纵行切口。在第一次切割时，将皮肤向两侧翻起以暴露颅骨。将剪刀的下刃置于枕骨大孔处，上刃置于颅骨顶部，沿颅骨上半部分剪至鼻部，完成第二次切割。将剪刀从部分切开的头部退出。将剪刀下刃置于颅底，上刃置于枕骨大孔处，沿正中线剪开头部下半部分至鼻部，注意避开内耳结构。对每一侧半头，使用镊子和剪刀去除颞骨周围的软组织，包括脑组织、肌肉和结缔组织。接着，用手将颅骨组织反向卷起，并用拇指轻轻按压颞骨下表面，逐步松解其周围附着结构。一旦内耳囊被取出，立即用PBS彻底冲洗。在显微镜下放置一个盛有4%多聚甲醛的Sylgard培养皿，将单个内耳囊置于其中。检查内耳是否有残留的软组织或骨组织，并小心去除。识别卵圆窗，并用镊子小心移除镫骨。接着，使用精细镊子在耳蜗顶处打开一个小孔。用P20移液器吸取4%多聚甲醛溶液，冲洗耳蜗，确保稀释的血液或内淋巴液从卵圆窗流出。将固定的耳蜗转移至盛有4%多聚甲醛的24孔板中，标记时间，并在摇床或振荡器上轻轻振荡孵育30至60分钟。孵育结束后，用PBS冲洗样本三次，每次5至10分钟。最后一次冲洗后，将耳蜗放入1.25毫摩尔/升的EDTA溶液中，在4°C下振荡2至3天。EDTA处理后，用PBS冲洗耳蜗三次，每次5分钟。 首先，将解剖得到的内耳囊放入10%蔗糖溶液中，在室温下孵育2小时。孵育结束后，将10%蔗糖溶液更换为20%蔗糖溶液，继续孵育2小时。随后，将20%蔗糖溶液更换为30%蔗糖溶液，在4°C下过夜孵育。次日，移除一半的30%蔗糖溶液，用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充空间，并让样本在振荡器上作用30分钟至2小时。将样本转移至预先标记并装满OCT包埋剂的冷冻模具中。检查耳蜗在包埋后的冷冻块中的方向，确保内耳的凹面朝向冷冻模具的窄边，以便获得标准的耳蜗横截面。 接着，在小容器中放入干冰，并加入5至10毫升的二甲基丁烷。将含有OCT和样本的冷冻模具置于冒泡的干冰上，迅速冷冻组织块。将冷冻块转移至已预冷至-20°C的恒冷切片机腔室内，使样本平衡30至60分钟。使用铅笔或钢笔在冷冻块上标记对应耳蜗位置的一侧，以确保切片时方向正确。然后，在样品夹（chuck）上滴加少量OCT包埋剂，将冷冻块放置其上，确保无铅笔标记的宽面朝下。将装有OCT和样本的样品夹放入冷藏的恒冷切片机腔室，待OCT完全冻结。数分钟后，将样品夹安装到样品夹持器上，使铅笔标记朝向右侧或左侧。在恒冷切片机上，使用40微米设置修整组织块，直至组织清晰可见。当组织显现后，使用专用于冷冻切片的载玻片收集厚度为12微米的切片。在显微镜下检查切片位置。若接近耳蜗回旋区域，则继续收集12微米切片，并定期检查位置，直至所有耳蜗回旋均被切片完毕。