基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

我们开发了一种基于荧光的方法来检测FEN1核酸酶活性并筛选小分子抑制剂，从而推动了诊断技术和靶向治疗研究的发展。

目前的表达检测面临诸多挑战，包括传统方法的复杂性和安全性问题，以及现有基于荧光技术所需的高成本和专用设备。

本方案解决了传统放射学方法和高成本荧光技术的不足，提供了一种更安全、高效且易于使用的检测方案。

我们的实验室将致力于优化高通量筛选平台，以探索FEN1抑制剂在癌症治疗中的体内应用及其作用机制。

[指导教师] 首先，根据FEN1的特异性切割活性设计DNA寡核苷酸链。将单链DNA寡核苷酸加入退火缓冲液中混合。加入10微升退火缓冲液和去离子水，使总体积达到50微升。随后，将反应混合物置于金属浴中，100摄氏度加热1分钟。立即转移至72摄氏度，孵育10分钟。然后关闭热源，使溶液逐渐冷却至室温，以形成完整的双链DNA底物。进行FEN1核酸酶活性检测时，首先将2微升DNA底物与FEN1核酸酶在反应缓冲液中混合。将反应混合物置于37摄氏度金属浴中孵育15分钟。加入20微升2X终止缓冲液以终止反应。随后，将20微升终止后的样品上样至预置的12%变性聚丙烯酰胺凝胶。以100伏电压电泳60分钟。完成后，在荧光成像系统下观察电泳结果。用移液器将2微升二甲基亚砜转移至1.5毫升微量离心管中。向管中加入2微升FEN1核酸酶和10微升2X反应缓冲液，以及6微升去离子水。充分混匀后，冰上孵育10分钟。孵育结束后，加入2微升DNA底物，使最终反应体积为20微升。接下来，通过将1摩尔储备液（溶于二甲基亚砜）进行两倍系列稀释，制备FEN1核酸酶抑制剂FEN1-IN-4的工作稀释液。向新的1.5毫升微量离心管中分别加入2微升FEN1核酸酶和2微升稀释后的FEN1-IN-4抑制剂。然后加入10微升2X反应缓冲液和4微升去离子水。轻轻混匀后，冰上孵育10分钟。随后向管中加入2微升DNA底物，使最终体积达到20微升。将反应混合物置于37摄氏度金属浴中孵育15分钟。然后加入20微升终止缓冲液终止反应。在约45千道尔顿处出现清晰的蛋白条带，表明从诱导表达中成功纯化了FEN1核酸酶。荧光素标记的双链DNA底物出现在80千道尔顿位置，与59千道尔顿的单链底物相比，证实了其成功合成。FEN1核酸酶以剂量依赖方式切割80个核苷酸的双链DNA底物，在0.5微克/微升浓度下观察到完全切割。FEN1-IN-4化合物显著抑制了FEN1对双链DNA底物的切割，表现为80个核苷酸条带的保留。FEN1-IN-4以浓度依赖方式降低FEN1核酸酶活性，其半数最大抑制浓度为14.03微摩尔。