无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

本方案展示了无细胞点印迹血液技术，这是一种为应对 COVID-19 大流行而开发的具有适应性、可及性和经济性的免疫检测平台。现有的免疫检测金标准方法包括 ELISA 技术及其变体和侧向流动检测。目前在开发新型免疫检测方面存在广泛兴趣，所用技术包括分裂报告蛋白、电化学界面和胶体纳米颗粒。

挑战在于，大多数金标准免疫测定方法由于依赖昂贵且复杂的分子组分和设备，难以在非中心化社区中获得。这种新型的CFDB免疫测定技术可快速适应新发疫情，仅需使用基本的实验设备，并完全依赖可在内部以及资源有限的环境中自行生产的分子组分。

首先，使用登录号 P0DTC9 从 UniProt 数据库中获取蛋白质序列。利用 IDT 密码子优化工具，针对大肠杆菌表达系统对该序列进行密码子优化。将优化后的序列插入 SnapGene 模板中用于表达载体的骨架，然后将优化序列作为单链 DNA 片段订购商业合成，并溶于水中。

在PCR管中，通过向大肠杆菌BL21无细胞反应体系中加入10%的PCR产物，进行初始的5微升规模表达测试。在30°C条件下静置孵育反应体系15小时。取1微升无细胞反应产物上样至12% SDS-PAGE凝胶，通过蛋白质印迹法（Western blot）检测核衣壳蛋白（NP抗原）的表达质量，并将其转移至硝酸纤维素膜上。

使用15纳摩尔纯化的线性表达模板产物，在1毫升规模下组装无细胞反应体系，用于无细胞点印迹检测。将表达混合物置于15毫升锥形管中，在30摄氏度下以80转/分钟振荡孵育15小时。通过蛋白质印迹法评估表达质量后，将50微升表达混合物分装，并于-20摄氏度保存。使用如图所示的主网格图像，其包含一个6厘米×6厘米的阵列，由12×12个直径为2毫米的圆圈组成，设计用于匹配96孔板的点样容量。

打印主网格后，将印有网格的一面朝下，紧密夹在两层粘性PCR板封膜之间，并沿网格外缘裁剪至合适大小。使用2毫米活检打孔器，在网格上每个标记的圆圈处打孔。裁取一块6.5厘米×6.5厘米的硝酸纤维素膜，将其置于洁净表面的主网格下方，并用胶带固定。

使用记号笔在硝酸纤维素膜上标记最外圈的位置，作为点样后裁剪膜的参考指引。用 PBS 将血清样本稀释至 1:10。使用微量移液器，将每份样本 0.4 微升的体积以三复孔形式点加到硝酸纤维素膜上预先确定的网格位置。

将点样的样品在室温下孵育并干燥10分钟。使用镊子小心取出硝酸纤维素膜，并沿标记的外圈剪下。将膜转移至含有10毫升封闭液的10厘米培养皿中。

在室温下轻轻振荡孵育30分钟，转速为100 RPM。从冷冻保存中取出50微升无细胞抗原表达混合物，待其解冻后，加入含有5毫升封闭液的10厘米培养皿中。将膜直接转移至该含抗原的溶液中，在室温下孵育1小时，同时以100 RPM振荡。

一小时后，用含0.05% Tween 20的TBST缓冲液冲洗并洗涤膜。接着，向膜中加入10毫升封闭缓冲液，其中含有每毫升10微克纯化的SpyCatcher、apex、two protein，然后将膜放入含有SpyCatcher apex的培养皿中。在100 RPM振荡条件下孵育一小时。孵育后，用Tris缓冲盐水（TBS）冲洗膜，再用TBST洗涤两次，每次五分钟，最后用TBS进行一次终洗。

在靠近印迹成像仪的洁净工作面上贴附并固定一块封口膜。用镊子夹取膜，轻拍去除多余液体后，将其放置在封口膜上。立即在膜上加入三毫升增强型化学发光液（ECL 溶液），于室温下准确孵育 90 秒。

轻拍干燥膜后，将其转移至适用于化学发光成像的仪器中。使用仪器的图像分析功能获取各点的信号强度，包括硝酸纤维素膜上三个空白位置的信号强度。每个点的测量体积应保持恒定。

将数据导出至电子表格，确保每个点样位置均正确标注。计算三份重复点样信号强度的平均值和标准差。从所有样品的测量值中减去硝酸纤维素膜的背景值。

然后，使用给定的方程计算出用于判断结果为阳性或阴性的临界值。最后，将减去临界值后的数据绘制成柱状图。本图展示了对已知特征的商用人类Sarah进行的无细胞点印迹实验，包括印迹图像及其对应的信号强度图表。

无细胞点印迹法成功鉴定了所有阴性对照样本和大多数阳性样本。在国家微生物实验室对该无细胞点印迹法进行的独立测试中，正确识别了全部12份阴性患者样本和12份阳性患者样本，证实了该方法的稳健性。无细胞点印迹法还检测到SARS-CoV-2感染的仓鼠Sarah体内的抗体反应，在再次感染后第五天采集的24份感染后样本中，有18份检测出阳性信号，而所有感染前样本均保持阴性。