使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程

我们的诊断学研究致力于在资源有限的环境中提高结核病耐药性的检出能力，重点关注检测的速度和实用性。在结核病诊断领域，目前已有一些更为全面的基因型检测方法，甚至出现了多种新型快速表型检测技术，并且一直有努力推动这些检测方法更接近临床诊疗现场。然而，仍存在诸多实际应用中的障碍。

从试剂到基础设施再到物流，资源方面的挑战仍然是重大障碍。除了像Cepheid Xpert检测这样技术上较为成熟的检测方法外，在不同环境中实现操作流程的标准化十分困难。因此，本研究所详细描述的结核分枝杆菌（MTB）DNA提取，便是这一问题的典型例证。

迫切需要扩大基于测序的结核病诊断技术的应用，但许多实验室仍然缺乏可靠的方法来提取高质量的DNA。我们的目标是分享一种简单、实用且适用于资源有限的即时检测环境的方法。本文介绍了一种设计用于资源有限环境的简单且低成本的实验方案。

该方法已通过NGS应用验证，并与自动化液体处理系统兼容。首先，将氯化钠溶液、Tris盐酸盐缓冲液、Triton X-100和EDTA混合，配制Triton缓冲液。搅拌混匀，并加入超纯水至终体积为100毫升。

使用前对缓冲液进行过滤除菌。接着，通过混合1毫升1摩尔的Tris-HCl和20微升0.5摩尔的EDTA，配制100毫升低EDTA的Tris-EDTA缓冲液。混匀后用超纯水定容至终体积100毫升。

然后对缓冲液进行过滤除菌。制备裂解管时，使用手术刀片在1.5毫升螺口管的拐点下方小心地将管底切除。剪去P1000移液器吸头的尖端，并在其末端附近制作一个V形楔口。

将螺口管的切口底部楔入V形移液器吸头中，制成一个勺状工具。用无菌容器盛装0.1毫米的氧化锆硅酸盐珠。使用制备好的勺具，将约200毫克的珠子转移至1.5毫升螺口管中。

在制备细菌细胞培养物时，将5毫升结核分枝杆菌培养物转移至15毫升锥形离心管中。以最大速度离心10分钟。然后使用10毫升血清移液管小心移除上清液，仅保留约500微升，注意不要扰动沉淀物。

使用 P1000 移液器吸除残留的上清液。将沉淀重悬于 350 µL 自配 Triton 缓冲液中，然后通过上下吹打充分混匀。将样品置于干浴器中，95 °C 加热 30 分钟。

取一到五毫升痰液样本，转移至无菌的50毫升离心管中，以制备痰液。进行二硫苏糖醇（DTT）液化时，向痰液样本中加入四倍体积的10毫摩尔二硫苏糖醇，然后充分涡旋振荡30秒。以最大转速离心样本10分钟。

然后使用10毫升血清移液管弃去上清液，仅保留500微升。用P1000移液器吸除剩余上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于350微升自制Triton缓冲液中。

进行NALC氢氧化钠液化时，向痰标本中加入四倍体积的NALC氢氧化钠溶液。将混合物涡旋振荡30秒，然后在室温下孵育7分钟。

现在加入 PBS 至 50 毫升刻度线。涡旋振荡管内物质以充分混匀，然后以最大速度离心 10 分钟。离心后，用 50 毫升血清移液管按之前演示的方法弃去上清液。

然后将沉淀重悬于350 µL定制的Triton缓冲液中。首先，将350 µL灭活样本转移至含有250 µL 0.1 mm氧化锆硅酸盐珠的已标记1.5 mL螺口管中。以每秒6.5米的速度对裂解液进行珠磨，每次45秒，循环间休息2分钟。

将样品在最大速度下离心两分钟，然后转移150微升上清液至一个新的已标记试管中。接下来，涡旋振荡已在室温平衡30分钟的纯化磁珠，以重新悬浮磁珠。将180微升磁珠转移至DNA样品中。

上下吹打10次以混匀。室温孵育2分钟后，将离心管置于磁力架上，静置2分钟，待溶液澄清。然后使用200微升移液器弃去上清液。

保持离心管仍在磁力架上，沿管壁对侧加入500微升新配制的70%乙醇，静置30秒。最后一次洗涤结束后，用10微升移液器吸除残留乙醇，并在空气中干燥两分钟。一旦磁珠变为不透明，立即将离心管从磁力架上取下。

用20 µL低EDTA Tris缓冲液重悬。通过移液或涡旋混匀，确保所有磁珠均处于溶液中，然后在室温下孵育5分钟。接着，将离心管置于磁力架上2分钟，直至溶液变澄清。

然后转移少于20微升的洗脱DNA至一个新的已标记试管中，以避免磁珠残留。为使用定量PCR（靶向分枝杆菌atpE基因的99个核苷酸）定量分枝杆菌DNA，请在冰上配制QPCR预混液。根据样本和标准品的数量调整预混液用量，并额外增加10%以补偿移液过程中的损耗。

将热循环仪程序设置为95 °C下运行60秒，随后进行35个循环：95 °C下10秒，60 °C下30秒，升降温速率为2.11 °C/秒。所有样本、标准品和对照均需设置三个重复。在此实验条件下，结核分枝杆菌培养物在所有测试条件中获得了最高的DNA浓度。

加标痰液样本显示，随着细菌输入量的减少，DNA 产量逐渐降低，变异程度增加，尤其在 10,000 细菌组中更为明显。