利用等离激元纳米镊子监测单个未修饰蛋白质的构象动力学

本研究旨在实时、无标记地在单分子水平上深入探究蛋白质，特别关注那些利用现有技术难以研究或与疾病相关的蛋白质。等离激元纳米镊子最近已展现出其在单分子水平上监测蛋白质与小分子结合后的构象动态、检测解离动力学以及阐明自由能 landscape 的能力。目前，尚无成熟的蛋白质表征技术能够用于研究无标记单分子蛋白质的构象动态。

人们认为，等离激元纳米镊子有望在该领域内填补这一空白。这一独特优势有助于我们研究蛋白质构象变化与其生物学功能之间的关系，以及其在疾病发展中的意义。未来的研究将聚焦于内在无序蛋白和膜蛋白，因为这些蛋白中的许多都与阿尔茨海默病、帕金森病以及多种癌症等疾病相关。

首先，使用直头镊子将PEG-巯基包被的样品放入3D打印的流动池中，确保金层朝上。剥去透明PET双面胶带一侧的保护膜，小心地将胶带覆盖在样品和流动游戏副本上，注意保持流动池中的纳米结构以及进液/出液孔不被遮挡。

使用圆头镊子轻轻按压胶带边缘，使其牢固粘附在流动池和样品上。撕去胶带另一侧的背衬，然后将盖玻片轻轻覆盖在样品上。使用圆头镊子按压盖玻片边缘，使其牢固粘附。

该过程在流动池内形成一个高度为50微米、体积为3.5微升的液体通道。使用小型移液枪头，在载玻片上按1:1比例或按照制造商说明，将复制型硅胶溶液A与溶液B等量混合。用混合好的复制型硅胶填充盖玻片与流动池之间的间隙，并轻轻将其推入盖玻片下方。

将流动池倒置，小心地在孔的内壁周围涂抹复制用硅胶。轻轻地将硅胶涂抹至样品底部熔融石英可见的边缘处，使样品的金层朝上放置直至干燥，直到复制用硅胶完全固化。确认所有组件均已正确连接后，在计算机上加载微流控系统用户界面。

单击 MUX 分配器和导线旁边的播放图标，它们分别控制 12 选 1 旋转阀和 3 通 2 位阀，以打开相应的接口。为绕过 3 通 2 位阀，请打开导线的 1 号端口。将流动池安装到等离激元纳米镊子时，需将入口和出口管路连接至流动池的相应部位。

将流动池放置在洁净的纸巾上，金层朝上。以约 0.3 毫升/分钟的高流速向流动池中注入缓冲液。检查液体是否流经流动池内的样品，并确保流动池外部或底部无液体渗出。

在100倍物镜上滴加一至两滴浸油。将流动池放置于等离激元纳米镊子载物台上，使金层朝下。使用金属夹固定在磁铁上方，锁紧载物台以确保其位置固定。

打开白光光源。启动相机软件，并调节曝光时间和增益，直至纳米结构可见。开启激光器至相对较高的功率，并手动调节Z轴，直至观察到激光光斑。

打开压电控制器，并为通信端口和最大电压选择适当的设置。将X、Y和Z轴的值设置为最大电压的一半，以便在所有方向上实现更佳的载物台对准。使用主载物台的X、Y和Z轴控制旋钮，将激光光斑与其中一个双纳米孔（DNH）结构对准。

确保雪崩光电二极管（APD）已开启。轻轻关闭等离激元纳米镊子的外壳。打开与APD记录相关的软件，例如自制的LabVIEW用户界面。编辑文件名，并将截止频率设置为1千赫兹。

然后指定文件将要保存的目标路径。关闭白光光源，并重新打开激光器。将激光功率调节至适当水平后，使用压电控制器调节X、Y和Z轴，直至APD信号达到最强。

避免APD饱和，并尽量减少轨迹的标准偏差。接下来，关闭激光器以延长纳米结构的使用寿命。运行注射泵控制单元和分配器用户界面，设置阀门并抽取所需量的蛋白质。

使用微流控装置界面，以与抽出速率相近的流速注入蛋白质溶液。以该流速持续注入，直至蛋白质溶液到达流式池。然后将流速设定为适合捕获的适当值，并等待信号稳定。

确认注射泵上的体积和时间与预期值一致。为记录APD信号数据，根据需要使用压电控制器用户界面调节X、Y和Z轴。当观察到透射率及其标准差发生显著变化时，记录下该事件发生的时间，以便后续数据分类。如果实验需要释放蛋白质，关闭激光器约五秒钟，然后重新开启。

曲线应显示出透射率的显著变化以及明显降低的标准偏差，表明已回到基线状态。实验完成后，关闭激光器，从三轴平台上取下流动池，并断开微流控系统的管路连接。

将流动池放置在洁净的纸巾上，金层朝上。使用手术刀，在玻璃盖片下方的胶水处小心切割，然后轻轻取下并丢弃盖片。将流动池倾斜持握，保持金层朝上，用圆头镊子小心地从流动池底部去除胶水，以释放样品。

使用直头镊子夹取样品，并用异丙醇彻底冲洗。使用气枪将样品吹干。一项在去铁铁蛋白分子上进行原位铁负载的代表性实验，展示了等离激元纳米镊子作为研究蛋白质构象动力学工具的应用。

载脂铁蛋白在 PBS 溶液中被捕获时，其透射轨迹保持稳定，表明未发生显著的构象变化。当暴露于亚铁溶液后，轨迹的标准差波动增大，表明伴随铁的加载发生了动态的结构变化。经过 20 分钟的铁暴露后，透射轨迹趋于稳定，表明载脂铁蛋白已由脱铁形式转变为全铁形式。

概率密度函数图显示，铁负荷后电压分布发生偏移，进一步支持了脱铁铁蛋白向全铁铁蛋白的构象转变。