利用共聚焦显微镜测定活细胞中线粒体形态

我们的研究聚焦于基础神经药理学。具体而言，我们研究药物分子的作用机制。我们的目标是理解潜在药物化合物与帕金森病中线粒体功能之间的关系。

以往的研究回顾了即使有制造商指南，实验室细胞分析仍长期存在的挑战。为解决这一问题，我们制定了一套详细的分步操作方案，用于评估实验室细胞中的线粒体形态。本方案采用一种简单的线粒体染色剂、荧光成像以及开源软件。

这可以降低成本，提高可及性，并且比电子显微镜等复杂替代方法更易于使用。首先，获取在含有DMEM/F12培养基的培养瓶中培养的SH-SY5Y细胞，该培养基需添加10% FBS。使用0.05%胰蛋白酶溶液消化细胞一分钟，使其脱离培养瓶表面。

传代前，将细胞以 100 G 离心 3 分钟。接着，将 SH-SY5Y 细胞悬浮于添加了 1% FBS 的 DMEM/F12 培养基中。然后将细胞接种至带有玻璃底的共聚焦培养皿中，并过夜培养。

进行MPP+刺激时，将培养基更换为含或不含1-甲基-4-苯基吡啶离子的新鲜培养基，处理24小时。进行MitoTracker染色时，用预热的DMEM/F12培养基稀释MitoTracker储存液，配制50纳摩尔的工作浓度。整个操作过程中需将染色液避光保存。

从共聚焦培养皿中移除培养基。用新鲜的 DMEM/F12 洗涤细胞两次。然后用移液器向培养皿中加入一毫升 MitoTracker 工作液。

在37摄氏度避光条件下孵育15分钟。随后去除MitoTracker工作液，用DMEM/F12洗涤培养皿两次。最后一次洗涤后，向每孔加入1毫升DMEM/F12。

成像前将样品置于细胞培养箱中孵育。为预先平衡共聚焦显微镜以进行成像，在采集面板中调整光路参数，设置激发波长和发射波长。将针孔大小设为1.2艾里单位，像素扫描尺寸设为1024×1024，像素驻留时间为2.4微秒，并进行两次平均扫描。

现在使用卤素灯，通过数值孔径为1.4的平场复消色差60倍物镜聚焦细胞，以尽量减少光毒性。将激光功率和高压调节至接近但略低于饱和水平。然后将缩放倍数设为3，并采集图像。

移动显微镜下的感兴趣区域，以观察其他细胞。然后在不更改任何设置的情况下采集图像。为在二值化和骨架化之前提高图像质量，首先打开图像。

使用 ROI 工具选择单个细胞的区域。随后依次点击“处理”、“滤镜”、“非锐化掩模”功能以增强清晰度。然后使用“处理”和“增强对比度”功能以减少噪声放大。

单击“process”（处理），选择滤波器和中值选项以去除椒盐噪声。要将图像转换为二值图像，请单击“process”（处理），然后选择“binary”（二值化），并选择“make binary”（生成二值图像）选项。对二值图像进行骨架化时，依次单击“process”（处理）、“binary”（二值化）和“skeletonize”（骨架化）。

然后通过选择分析、骨架，再选择分析骨架 2D/3D 功能，对所有骨架像素进行分组。使用 MiNA 工具计算骨架化图像中的九个描述性参数，以简化分析过程。线粒体染色的荧光强度随着 MitoTracker Red CMXRos 浓度从 25 纳摩尔增至 200 纳摩尔而逐渐增强。

但在200纳摩尔浓度下，观察到明显的细胞质背景染色。染色后一小时，与PBS相比，DMEM/F12培养基中线粒体形态保持更佳，尽管DMEM/F12也表现出较高的背景荧光。与单次扫描模式相比，双帧平均显著提高了线粒体成像的信噪比。

将像素驻留时间从 2.4 微秒增加到 10.8 微秒可获得更亮的图像，但会导致光漂白。提高高压会增强背景噪声，而增加激光功率则会引起光漂白。MiNA 工具对弱荧光和强荧光图像均能产生一致的骨架化结果，表明其在不同荧光强度下均具有稳健的分割能力，其中强荧光图像的强度比弱荧光图像高 5.5 倍。

与未处理的对照组相比，500 微摩尔浓度的 MPP+ 处理导致 SH-SY5Y 细胞线粒体形态破坏，线粒体投影面积显著减少。