在衰老过程中对C. elegans线粒体形态进行成像与定量分析

本方案提供了一种标准化的方法，用于对多种组织中线粒体形态的变化进行成像和定量分析。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，线粒体形态通常与其功能相关。在多种疾病状态以及衰老过程中，均可观察到线粒体形态的改变，这些改变往往与线粒体功能失调相关，不同组织间亦可观察到差异。

表现出独特的线粒体结构，需要采用特定的成像策略。因此，选择合适的显微镜并优化样品制备对于成功实现线粒体及秀丽隐杆线虫（C. elegans）的组织特异性成像至关重要。在此，我们选择使用表达线粒体定位GFP的转基因线虫品系，而非传统的线粒体染料。

这使我们能够避免脱靶效应、非完全外显率，以及使用染料观察不同组织中线粒体时所需复杂的样品制备步骤。我们实验室的主要研究方向是探究应激和衰老过程中的线粒体稳态。标准化线粒体成像方案对于最大限度减少外部干扰误差，并在不同生物学条件下获得可重复的线粒体形态变化结果至关重要。

首先，取干净的载玻片。进行样品制备时，在载玻片上加入 10 至 20 微升 M 九溶液，并将所需数量的特定年龄的成虫放入该溶液中。将虫体置于载玻片的 M 九溶液中后，盖上盖玻片，以观察肌肉结构。

线粒体，轻推盖玻片使线虫滚动。然后用指甲油密封盖玻片边缘，防止M9溶液蒸发。使用标准的宽场显微镜对表达荧光标签的肌肉和表皮线粒体进行成像。

使用共聚焦显微镜对肠道线粒体进行成像，并优化成像参数以适应特定的实验设置。开始分析前，在安装完成后打开 Fiji 软件，下载并安装 mito mapper 宏。首先，下载源代码版本。

复制下方 A 部分中列出的 IJM 代码，用于 MIT mapper 1.0。打开 Fiji，依次点击插件（plugins）、新建（new）和宏（macro），将复制的代码粘贴到宏窗口中。然后通过文件（file）菜单中的“另存为（save as）”选项保存该宏，以便将来使用。

导航至“文件”，然后选择“打开”，以在 Fiji 中打开一个带有 Z 轴的三维显微图像。在 Fiji 中，依次点击“图像”→“堆栈”→“Z 投影”，创建最大值投影。选择处于焦内范围的切片进行最大值投影，并将投影类型设为“最大强度”，以保存投影后的图像。保存为 TIFF 格式时，前往“文件”菜单，点击“另存为”，然后选择“TIFF”。

使用矩形工具从整幅图像中裁剪出感兴趣区域，然后导航至图像并执行裁剪。依次点击文件、另存为，选择 TIFF 格式以将裁剪后的图像保存为 Tiff 文件。将先前保存的 mito map 或宏文件拖放到 Fiji 工具栏中。

单击运行。当提示选择文件夹时，选择包含上一步保存的 TIFF 文件的文件夹。当提示选择区域时，使用矩形工具在图像中创建一个矩形，然后按确定以确认。

最后，转到文件菜单，将所有与线粒体形态相关的数据值保存为点 CSV 文件。线粒体形态具有组织特异性：在肌肉中，线粒体呈管状，并沿肌纤维排列；在肠道中形成相互连接的网状结构；而在表皮中则多呈圆形或椭圆形。使用共聚焦显微镜对线粒体进行成像，通过减少非焦平面光线的干扰，相比复合显微镜显著改善了肠道线粒体的可视化效果。

在载玻片上，线粒体在 M nine 缓冲液中孵育 30 分钟后出现断裂，其中表皮线粒体的断裂现象最为显著。衰老导致所有组织中的线粒体发生断裂，表现为截短状和球形结构。MIT mapper 定量分析表明，肌肉中的线粒体对象长度发生变化，而表皮下组织中的连接点数量发生变化。