通过动态三维荧光显微图像理解线粒体形态的变化
2025年8月15日
本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。
本研究的目的是观察线粒体网络的变化，并探究这些线粒体网络如何响应细胞条件而发生改变。我们使用Fiji和Python等开源工具，结合现有函数库与自定义宏及脚本，以实现从复杂的荧光显微镜数据中自动分析线粒体形态。目前仍存在的挑战是，如何获得可靠的定量数据和指标，用以描述线粒体分裂与融合的动力学过程及其在三维空间中的定位。
此类数据生成的标准化方法尚不普遍。因此，关于细胞特异性的分裂与融合频率及其细胞内定位的知识仍然有限。我们已将线粒体分裂与融合的活体检测纳入现有的研究指标体系。
通过将这些参数与线粒体结构数量相结合，我们能够定义一种用于理解线粒体网络动态的新指标。我们的研究结果使我们能够表征细胞特异性的分裂和融合参数，并首次确定线粒体系统处于稳态还是正在发生转变。这可避免在健康与疾病状态下对表型的严重误读，并为准确报告提供了清晰的框架。
首先，在 ImageJ 中打开原始文件。调整颜色设置以增强目标区域的可见性，但不要进行任何设定。根据需要分析的单个细胞数量复制图像。
如果视野中存在多个细胞，导航至分析（Analyze）菜单，选择工具（Tools），使用同步窗口（Synchronized Windows）工具和手绘选择（Freehand Drawing）工具在目标细胞周围绘制感兴趣区域，然后选择编辑（Edit）并点击清除外部（Clear Outside）以分离选定的细胞。将红色和蓝色通道分离，并将线粒体通道保存为 tif 文件。为生成点扩散函数（point spread function，PSF），请重新打开原始图像。
然后通过选择“插件”，再选择“PSF生成器”并选择“Born Wolf 3D光学模型”来打开PSF生成器插件。通过选择“图像”，然后选择“显示信息”或按键盘上的I键，打开原始图像的图像信息。滚动至图像信息窗口的底部。
选择体素大小和深度选项，并将波长更改为 568 纳米。将 XY 像素大小设置为 166.1 纳米，Z 步进设置为 200 纳米。将 XYZ 尺寸设置为匹配 512 × 512 的图像分辨率，并配置 Z 轴堆栈包含 10 个 Z 层面。
单击“运行”。将点扩散函数（PSF）保存为其独立文件夹中的 tif 文件。导航至“插件”菜单，选择“宏”，然后依次选择“编辑”和“Deconvolution_time_lapse_mine”。
点击 ijm 以访问去卷积宏。根据需要编辑输入和输出行，然后按“运行”以执行该宏。如需增强图像对比度或进行模糊处理，请导航至“插件”，选择“宏”，选择“编辑”并打开“预处理”。
点击 ijm 以访问预处理宏。通过将滚动球半径设置为 6 来执行背景减除。设置 Sigma Filter Plus，使其半径等于尺度因子的 1 倍。
使用的像素数量为 2，最小像素分数为 0.2，确保插件设置为识别异常值。通过将块大小设置为 64、直方图区间数设置为 256、最大斜率设置为 2.5、伽马值设置为 0.8，调整 CLAHE 参数，然后点击运行。打开一个经过预处理修改后的感兴趣文件。
ImageJ 中的 ijm 宏。导航至“插件”并选择“自适应阈值”。将局部阈值设置为加权均值，并根据需要调整像素块大小。
单击“预览”并调整区块大小，以尽可能清晰地包含更多的线粒体。针对每个细胞修改相减值，以消除不必要的背景，并记录所得的显微图像。为优化时间效率，可根据所应用的相减值将图像分类存储到不同文件中。
现在导航至插件，选择宏，选择编辑并打开 Threshold. ijm 以访问阈值宏。编辑宏脚本以定义正确的输入和输出路径、块大小以及减去值。
单击“运行”以执行宏。打开最多 10 个属于相同处理条件的阈值化显微图像。导航至“图像”→“堆栈”→“工具”，选择“拼接”，然后点击“确定”。为去除阈值化后残留的小斑点，请进入“插件”，然后选择“积分图像滤波器”，再选择“去除异常值”。
使用预览功能微调 X 和 Y 尺寸以消除碎片。将拼接后的文件保存为 TIF 文件。最后，依次进入插件、宏、编辑、QuickTest_new.ijm。
编辑输入和输出路径行，使其指向相应的目录，点击运行并可视化线粒体事件定位器（MEL）结果。通过红色点状信号标记分裂事件、绿色点状信号标记融合事件，可在3D和2D视图中随时间追踪线粒体动态变化。随时间推移，不同处理组的线粒体网络在结构上表现出特异性差异：经二甲双胍处理的细胞中线粒体形态更长且相互连接，而经二甲双胍联合CCCP和Baf处理的细胞中则呈现高度碎片化的网络结构。
二甲双胍联合CCCP和Baf处理组的线粒体分裂与融合活性显著高于对照组或仅使用二甲双胍处理的组，提示线粒体重塑增强。该组的线粒体数量也显著增加，与线粒体碎片化增强一致。同一组的线粒体体积显著减小，进一步支持向分裂方向转变的趋势。
然而，当以线粒体数量进行标准化后，仅使用二甲双胍的组别表现出最高的相对动态活性，表明单独使用二甲双胍可促进更为活跃且高效的重塑网络，而联合治疗则导致广泛但效率较低的结构更替。
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概述
本研究介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，旨在量化线粒体分裂与融合随时间发生的三维变化。研究还概述了在分析前用于增强显微图像的图像处理流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 图像处理
背景
- 线粒体网络对细胞功能至关重要。
- 理解分裂与融合动态对于揭示细胞健康状态至关重要。
- 目前尚缺乏针对这些过程的标准化度量指标。
- 现有的分析工具通常需要进行定制化调整。
研究目的
- 观察不同细胞条件下线粒体网络的变化。
- 从荧光显微镜数据中自动分析线粒体形态。
- 加深对细胞特异性分裂和融合频率的理解。
使用的方法
- 利用 Fiji 和 Python 等开源工具。
- 开发自定义宏和脚本以实现自动化。
- 实施新的图像处理流程。
- 将线粒体裂变与融合的活细胞检测纳入研究指标。
主要结果
- 获得了线粒体动力学的可靠定量数据。
- 提出了数据生成的标准化方法。
- 提供了关于线粒体在三维空间中定位的新见解。
- 建立了用于分裂和融合频率的新度量指标。
结论
- MEL 插件显著有助于线粒体动力学的分析。
- 标准化方法可提高研究的可重复性。
- 需要进一步研究以探索细胞特异性的线粒体行为。
常见问题
行业重要性概述
线粒体裂变与融合动态的定量三维分析对于降低与细胞应激及药物反应相关的早期发现假设的风险至关重要。所述分析流程及MEL插件可实现线粒体网络重塑的标准化、可重复测量，直接支持靶点验证和机制研究中的预测可信度。该能力通过阐明药物干预下细胞表型的变化，增强了项目决策的科学性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在化合物处理或应激条件下，实现对线粒体重塑的定量分析。
- 通过区分线粒体的平衡状态与动态转变状态，支持作用机制的风险评估。
- 在细胞特异性背景下提供标准化的功能性靶点验证指标。
- 有助于可靠预测线粒体动力学与疾病相关表型之间的关联。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程准备经过验证的三维生物成像数据。
- 标准化图像处理和事件检测，以获得可重复的检测结果。
- 实现对不同处理组间线粒体形态变化的高内涵筛选。
- 通过量化裂变、融合及网络结构等指标，支持对化合物的可靠评估。
转化与临床前研究
- 在数据支持下，将线粒体动态参数与疾病相关的细胞模型相匹配。
- 实现从发现阶段成像到临床前表型验证的连续性。
- 基于定量的线粒体重塑数据，支持风险调整后的推进决策。
- 支持转化研究流程中的机制性去风险化。
流程与工作流整合
该流程整合了从早期发现成像到先导化合物鉴定及临床前模型验证的各个环节，支持在每个阶段进行假设检验和机制解析。
- 发现生物学：量化线粒体分裂与融合事件，以阐明通路对干预措施的响应机制。
- 筛选：提供可重复的定量输出，用于检测方法开发和化合物初筛。
- 分析：提供标准化的读数，用于比较不同处理条件和细胞表型。
- 转化研究：在明确疾病相关性后，将发现阶段的成像结果与临床前模型评估相衔接。
- 企业级复用：提供可重复使用、开源的工作流程，适用于多种细胞类型和实验条件。
运营与企业影响
- 科学价值：提高线粒体生物学研究中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化图像分析，提升不同团队间研究的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过明确细胞应答，支持更优的“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：支持针对线粒体功能的发现项目进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备荧光显微镜和图像分析方面的专业知识。
- 依赖于对开源工具（ImageJ/Fiji、Python）及兼容计算基础设施的访问。
- 要求跨团队对成像和分析流程进行标准化，以确保可重复性。
- 通过适当的参数调整，可适用于多种细胞类型和实验模型。
- 受限于对高质量三维时间序列成像的需求以及对阈值优化的精细调控。
