通过模拟监督学习分析线粒体形态

我们展示了一种在固定细胞的荧光显微镜图像中分析线粒体的基于模拟监督的机器学习工具。目前对显微镜图像中的线粒体进行分割的方法包括基于自动阈值的方法（如Ostu法）或手动分割。当信噪比较低时，基于阈值的技术表现较差。

通常，用于形态学分析的图像包含大量线粒体，使得手动分割十分繁琐。有监督的深度学习方法虽能实现高精度分割，但需要大量输入的真值配对数据用于训练。该方法采用基于物理的模拟器生成显微图像及其对应的二维真值形状掩膜配对，从而消除了对人工标注的需求。

使用模拟图像训练的模型随后被用于在真实显微镜图像中分割线粒体。我们采用一种基于深度学习的分割工具，可高精度地实现该任务的自动化，且无需标注的真实数据集进行训练。模拟过程首先通过参数化曲线生成形状，以完成几何结构的构建。

发射源在生成的形状表面上均匀分布且随机放置，使其密度与实验值相匹配。使用 Gibson-Lanni 模型计算显微镜的三维点扩散函数（PSF）。为了在模拟图像与实验图像之间实现光度真实感，我们同时模拟了暗噪声和散粒噪声。

物理学真实值以二值图的形式生成。我们评估了使用共聚焦显微镜成像的经CCCP处理对固定心肌母细胞线粒体形态的影响。细胞培养。

在无菌超净工作台中进行操作，为细胞接种做准备：将每个实验条件的盖玻片放入12孔板的各孔中。在向各孔加入适当体积的细胞悬液前，通过反复吹打离心管中的内容物数次，确保稀释后的细胞悬液充分混匀。实验步骤。

从12孔板的各孔中吸除细胞培养基，然后迅速向对照孔加入新鲜的预热培养基，并向实验组孔中加入含有10微摩尔CCCP溶液的预热培养基。在37摄氏度细胞培养箱中孵育两小时。吸除各孔中的细胞培养基，加入预热的固定液。

在盖玻片上进行细胞染色与封片。向准备好的载玻片上加入10微升封片介质，用于封固盖玻片。使用镊子从12孔板中取出盖玻片，并通过轻轻触碰盖玻片边缘及其背面至预先准备好的无绒纸巾，以吸除多余水分。

将盖玻片轻轻放下，覆盖在已滴加封片剂的液滴上。使用显微镜进行观察和成像。通过目镜手动调节Z轴高度，使样本聚焦清晰。

在软件中切换到“已获取”选项卡。使用智能设置选择用于成像的荧光通道。以盖玻片中心为阵列中心，共设置12个成像位置。

将RA定位在盖玻片中心。可通过自动化方式对多个位置进行成像。生成模拟训练数据。

下载代码并解压文件内容。按照说明和自述文件设置环境。导航至名为 src 的文件夹，复制一份或使用文件夹 2。

线粒体模拟 airy”并重命名。该文件夹包含与训练数据模拟相关的所有文件。模拟需要设置三组参数。

首先，在批处理配置文件中设置模拟器的线粒体数量、直径范围、Z轴范围以及荧光分子密度参数。接着，在 microscopePSFmode.py 文件中设置数据集的数值孔径、放大倍数和最小波长等光学参数。然后，在 fire generate_batch_parallel 中设置所需的像素尺寸和发射波长值。

在 generate_batch_parallel.py 文件中设置第三组关于输出数据集的参数，例如输出图像的尺寸、每幅图像中的图块数量以及文件中生成图像的总数。运行 generate_batch_parallel.py 文件以启动模拟。

为获得最终尺寸的图像，复制名为“5. 数据准备和训练/数据准备”的文件夹并进入该文件夹。在 Data_generator 文件中设置批次数量、每批次图像数量以及要添加的噪声范围等参数。

运行文件 Data_generator.py 以生成拼接图像。将名为 image 和 segment 的文件夹复制到 data/train/train 文件夹中。

基于深度学习的分割。为了在新的显微镜图像设置下训练分割模型，请进入名为 train 的文件夹，并在名为 train_unet.py 的文件中设置用于训练的批量大小、分割的骨干模型、训练轮数以及学习率。运行 train_unet 文件。

py”以启动训练。训练过程将显示在模拟验证集上评估分割模型的指标。训练完成后，模型将被保存为 best_model。

为了在显微镜图像上测试模型，必须将图像分割为训练模型所需的理想尺寸。为此，请进入名为“6. Prepare test data”的文件夹，将数据的PNG格式文件复制到“PNG”文件夹中，然后运行文件split_1024_256。

这将生成数据文件夹中图像的 256 × 256 尺寸裁剪。要对图像裁剪进行分割，请进入名为“7. Test segmentation”的文件夹并运行名为 segment 的文件。

py”，然后设置要使用的已保存模型的名称。分割后的图像将保存到输出文件夹中。形态学分析。

将名为 make_montage.py 的文件放入名为 7. Test segmentation 的文件夹中，并运行该文件，以将分割后的输出结果拼接回图像的原始尺寸。

在源文件夹中创建一个名为“9. 形态学分析”的新文件夹，然后进入该文件夹。使用命令 pip install seaborn skan 安装 skan 和 seaborn 库。使用名为 skan 的库对分割掩膜进行骨架化，以实现对单个线粒体拓扑结构的分析。

将文件放入文件夹“9. 形态学分析”中，将实验中不同组别的图像分别整理到文件夹“7. 测试分割”内的不同子文件夹中，然后运行该文件以生成用于分析的结果图表。

要进行的定量分析取决于研究问题或假设。在本实验中，我们关注线粒体的三种不同形态，即点状“小型线粒体片段”、杆状“纤维状或串状线粒体”以及多分支网络状“多分支网络”。为识别这些形态，我们首先对分割结果进行骨架化处理，然后分析不同类别中的分支连接情况。我们展示了半乳糖适应细胞两组样本的分析结果，分别为对照组和CCCP处理组。

我们观察到点状线粒体的平均分支长度显著增加，这符合预期，因为线粒体在暴露于CCCP时会发生肿胀。当细胞经CCCP处理后，棒状和网络状两类线粒体在各个长度区间所占的百分比均显著低于对照组，从而验证了我们的假设。本方法面临的一个挑战性情况是图像中线粒体密集排列时。

粉红色表示图像中检测到的最长的单个线粒体，这是由于分割结果中的误差增大所致。这些失败情况可以通过控制线粒体长度并结合形态学操作来识别。尽管我们的应用仅展示了线粒体形态分析的一种实现方式，但我们认为，围绕线粒体自噬及相关生物学实验的各个方面，均可建立类似的分析方法和研究问题。