使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程
2025年10月17日
该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸<1 μm）且数量稀少（每细胞仅1个拷贝）的荧光标记生物结构进行薄片制备。该平台将荧光显微镜、聚焦离子束刻蚀和扫描电子显微镜集成于同一焦平面，可在刻蚀过程中同步进行荧光成像。
我的研究开发了光学显微镜方法，用于在聚焦离子束铣削过程中保护低温薄片中的细胞结构，从而通过低温电子断层扫描技术实现对天然生物结构的详细分析。尽管光学显微镜已集成到CryoFIB-SEM系统中，但很少与聚焦离子束（FIB）位于同一位置。因此，必须采用基于图像配准的引导方法，以在最终的薄片中保留荧光标记的目标结构。
首先，当载台达到低温温度后，使用液氮手动冷却转移站。将一个已夹好的自动网格载入专为低温光学显微系统设计的样品盒中。确保自动网格位于粘附的盖玻片与间隔片之间。
拧紧环形螺钉以关闭样品盒，并将其插入转移站的插槽中。将转移站连接到低温光学显微系统。使用腔室内置摄像头引导样品盒进入样品台。
在光学显微镜软件中，将样品台从加载位置移动到预定义的三束位置。在聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）软件中，将放大倍数设置为100倍，然后单击左上窗口。在光学显微镜软件的对齐选项卡中，单击Z轴并选择播放功能，以获取载网的扫描电镜图谱。
找到碳膜破损的方形区域，双击该区域以将样品台移至该位置。返回软件界面。启动聚焦离子束（FIB）并获取图像。
使用左上角的下拉菜单调整放大倍数。点击播放以显示FIB图像，然后使用滑动条设置步长。
现在点击 Z 和 Z 调整载物台的 Z 轴位置，直到离子图像和电子图像中的水平线与同一特征对齐。在光学显微镜软件中选择 SEM 选项卡。使用 或 X 和 Y 按钮对齐 SEM 图像与离子图像之间的共同特征。
现在打开荧光显微镜。选择 FLM 选项卡，设置反射光成像条件，然后点击播放。接着将反射光图像与 SEM 图像对齐。
放大图像，点击矩形选项以定义离子束的铣削图案。在显示窗口2中按“开始图案化”按钮，使用聚焦离子束铣削出一个小图案。确认在聚焦离子束和荧光显微镜视图中均可观察到铣削后的图案。
在光学显微镜软件中，转到定位（Localization）选项卡，激活相应条件以设置荧光通道。将每种荧光染料分配至独立的通道，并为明场增加一个额外通道。调整每个荧光通道的LED光源功率和曝光时间，以识别目标结构。
当参数设置满意后，通过沿轴向逐层移动，采集研磨前的荧光z轴层扫图像。随后将目标区域标记为感兴趣区域。切换至FIB-SEM软件，并在感兴趣区域绘制薄片。
进行粗铣以去除大部分材料，同时保持荧光显微镜开启以监测信号变化。从终端打开基于 Python 的干涉测量工具包，以在薄片减薄过程中监测荧光信号。使用清洁截面模式将目标区域减薄至约两微米。
对于轴向尺寸超过300纳米的目标，在Python图形用户界面中选择荧光显微图像中的目标。软件将自动开始绘制每个新帧的亮度随时间变化曲线。通过Python工具包监测荧光强度。
使用清洁横截面模式研磨样品，以去除兴趣区域下方残留的任何支撑膜。观察荧光强度是否突然下降，并以此作为切换研磨方向的提示。如果从下向上研磨时观察到荧光强度急剧下降，则应停止研磨，改为从上向下进行研磨。
完成自上而下的切削后，以自下而上的方式在清洁截面模式下继续切削，直至达到目标厚度，从而完成薄片的制备。随后采集薄片在切削后的荧光图像。将样品转移至冷冻透射电镜（CryoTEM）中。
将研磨后的多通道荧光图像和冷冻透射电镜投影图像载入自定义的投影变换软件中，以进行感兴趣区域配准。随后选择8到10对在荧光图像和电子显微镜图像中均可辨识的参考点，用于计算投影变换。利用叠加图像作为指引，选择成像区域。
然后根据目标结构的大小和所需的分辨率，选择合适的放大倍数和倾转系列采集参数。用SiR-Tubulin标记的分化巨噬细胞显示出一个明亮的荧光点状结构，直径约一微米，对应于微管组织中心（MTOC），并伴有呈纤维状向细胞周边辐射的结构，符合微管网络的特征。当样品被切削至厚度约为800纳米时，原本单一的荧光MTOC点状结构分解为两个独立的斑点，每个斑点直径约为700纳米。
在去除非荧光性的块体材料和吸收性支撑膜后，荧光强度增加，随后当薄片从两微米进一步减薄至200纳米以下时，荧光强度急剧下降。关联的低温荧光显微镜与电子显微镜技术实现了在切削过程中对结构的精确定位。重建的断层图像和分割模型显示，中心粒由微管三联体构成。
在最终的薄片中仅保留一个荧光斑点的情况下，可在相应的断层图像中观察到单个中心粒。基于微铣削的荧光定位精度受限于图像配准方法，后者受到衍射极限分辨率、折射率不匹配以及铣削引起的位移等因素的严重影响。同步进行光学显微镜成像与聚焦离子束（FIB）铣削可消除配准误差，转而利用荧光显微镜的实时反馈来引导铣削过程。
这可以避免因衍射极限和折射率不匹配导致的误差，从而实现精确的切削加工，保护最终薄片中荧光标记的结构，以便进行冷冻电子断层扫描。我们的研究使得此前难以通过冷冻电子断层扫描直接观察的细胞结构得以清晰呈现，为揭示多种关键微分子机器背后的分子机制提供了新的视角。
概述
该工作流程能够制备针对体积微小且稀有的荧光标记生物结构的低温薄片。通过将荧光显微镜、聚焦离子束刻蚀和扫描电子显微镜整合在同一焦平面，可实现成像与刻蚀的同步进行。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 显微技术
背景
- 光学显微镜技术对于在切削过程中保持细胞结构至关重要。
- 将荧光显微镜整合到冷冻聚焦离子束-扫描电镜（CryoFIB-SEM）系统中的情况较为罕见。
- 基于图像配准的引导对于维持荧光标记目标的位置至关重要。
- 理解生物样本的天然组织结构对于进行精细分析至关重要。
研究目的
- 开发用于在低温薄片中保存细胞结构的方法。
- 通过低温电子断层扫描技术实现精细结构分析。
- 提高在切削过程中对荧光结构定位的准确性。
使用的方法
- 使用液氮手动冷却转移站。
- 将荧光显微镜与聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）系统整合。
- 获取铣削前的荧光z轴层析图像。
- 利用Python工具包在铣削过程中监测荧光强度。
主要结果
- 去除无荧光的主体材料后，荧光强度增加。
- 关联冷冻荧光显微镜与电子显微镜实现了精确定位。
- 重构的断层图像揭示了中心粒的结构。
- 在某些情况下实现了单个中心粒的可视化。
结论
- 本研究展示了有效的低温切片制备方法。
- 基于荧光的定位技术提高了结构分析的准确性。
- 成像技术的整合增强了对生物组织结构的理解。
常见问题
行业重要性概要
冷冻荧光、电子和离子束显微镜的同步成像技术可在为冷冻电子断层扫描制备薄片的过程中，对稀有细胞结构进行精确的实时定位。该工作流程消除了图像配准误差，增强了与疾病相关的亚细胞特征的保存效果，直接影响早期发现及机制层面的风险排除。该方法提高了结构生物学流程中预测结果的可信度，并有助于针对复杂生物靶点做出基于风险评估的项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在样品制备过程中直接观察并保存荧光标记的亚细胞靶标。
- 通过保持稀有或微小结构的完整性，减少机制研究中的不确定性。
- 通过将荧光信号与超微结构数据相关联，提高靶标验证的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为后续高分辨率成像和定量分析制备经过验证的薄片样本。
- 在铣削过程中集成实时荧光反馈，支持可重复的样本制备。
- 有助于标准化筛选稀有细胞事件或表型的工作流程。
转化与临床前研究
- 当荧光标记物标记与疾病相关的特征时，可将结构保存与转化生物标志物发现相结合。
- 通过支持关联成像策略，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过提供关于目标分子的高保真结构数据，降低研发推进决策的风险。
流程与工作流整合
这种三重共定位成像工作流程在发现生物学与结构分析的交叉界面上进行整合，将早期靶点验证与临床前模型表征连接起来。
- 发现生物学：通过在切削过程中直接观察标记结构，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的薄片制备，用于下游成像分析。
- 分析：提供实时荧光强度测量，以指导并记录样本处理过程。
- 转化研究：在分子标记与超微结构读数之间保持对齐，用于生物标志物研究。
- 企业级复用：建立可重复使用、标准化的工作流程，以在不同项目中靶向多种细胞结构。
运营与企业影响
- 科学价值：提高结构生物学中的预测置信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强薄片制备的可重复性与标准化，以实现高分辨率成像。
- 战略价值：通过提供针对稀有靶标的可靠结构数据，改善决策过程中的立项或终止判断。
- 项目组合影响：基于直接的结构证据，实现对靶标的按风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备冷冻显微镜、荧光成像和聚焦离子束操作方面的专业知识。
- 需要能够同时实现三模态成像与切削的集成化仪器设备。
- 需要跨团队统一成像参数和样品处理流程的标准。
- 针对不同细胞类型或标记策略，可能需要进行方法调整。
- 实际限制因素包括荧光信号的稳定性以及切削过程中可能产生的运动伪影。
