超分辨率超声定位显微成像用于啮齿类动物脑微血管系统的精细定位

我们的研究旨在表征脑微血管结构与血流，同时优化超分辨率超声成像方法。近期进展已优化了微泡追踪技术，并加强了数据处理流程，从而建立了更为稳定的超分辨率血管图谱成像（ULM）方案。首先，将麻醉后的小鼠置于设定为37摄氏度加热垫的立体定位仪上。

使用稳固但无损伤的压力，捏住小鼠的脚趾或尾巴，检查反射是否消失，以确认麻醉深度足够。在两只眼睛上涂抹眼膏，以防止手术过程中发生角膜溃疡和白内障。现在，使用修剪器剃除小鼠头部的毛发。

涂抹脱毛膏，最多静置1至1.5分钟，然后用温水彻底冲洗，并用纱布擦干。接着，将离心后的超声耦合凝胶涂抹于头部，以确保声学耦合。

进行尾静脉插管时，使用一个27号半英寸带翼输液套件，连接至一个18号半英寸针头，并配有八英寸长的导管。如有可能，缩短导管长度以尽量减少死腔体积。轻柔地将动物尾巴旋转90度，以暴露尾部侧静脉。

然后用胶带将尾巴固定，以保持稳定并防止插管过程中移动。现在，确定尾静脉的位置。为提高静脉的可见度，可用温水加热尾巴，以促进血管扩张。

用手指轻轻按压尾部基部，然后朝向注射部位逆着血流方向滑动。将针头斜面向上，平行于静脉插入。观察导管内是否有回血，以确认针头位置正确。

在成像系统上启动功能超声采集软件，并创建一个新的实验会话。调整超声探头的位置。现在，在软件中开始实时成像采集，并使用功率多普勒成像实时调整探头，使大脑图像居中显示在屏幕上。

优化成像参数（如对比度和压缩），以提高可视化质量。然后，在采集软件中打开 Angio 3D 菜单。调整扫描参数以完全覆盖脑部，随后开始扫描采集。

保持采集软件处于打开状态，Angio 3D 扫描完成后，启动 IcoStudio 软件进行分析和可视化。加载 Angio 3D 扫描数据以供查看。进入脑部配准面板，使用全自动或手动模式对 Angio 3D 扫描数据进行配准。

将完成的配准保存为 BPS 文件。现在，打开脑导航菜单，向下滚动至图谱管理器面板。使用父级和子级树形导航器浏览 Allen 小鼠脑图谱，并在三视图面板中选择需要叠加的目标解剖区域。

选择一个与选定的兴趣区域重叠的成像平面。在冠状面视图中，手动放置两个标记以定义所需的成像切片。然后，单击 BPS 定位以提取所选成像平面的电机坐标。

查看Angio 3D扫描的图像预览，点击复制BPS坐标。切换至IcoScan软件，打开移动探针面板。点击神经导航，粘贴已复制的坐标值，系统将自动将探针对准所选的成像平面。

然后，开始活体成像，以确认当前成像平面与先前选定的平面一致。使用无菌注射器，通过隔膜向超声造影剂微泡小瓶中注入5毫升0.9%氯化钠溶液。剧烈震荡小瓶20秒，以重新悬浮微泡并确保均匀分散。

预定义记录参数，包括超声序列、帧率和总记录时长。然后抽取所需体积的微泡用于注射，并开始数据采集。采集开始后，使用适当稀释度向小鼠注射 100 微升微泡。

在实时可视化面板上确认对比增强效果。通过向导管内注射生理液体，立即冲洗死腔中残留的微泡。等待采集完成，并保存记录的数据。

打开 Icolab 软件，点击超声定位显微成像（Ultrasound localization microscopy）选项卡，然后点击“计算 ULM 图像”（Compute ULM maps）以启动处理流程。选择包含先前采集数据的源文件夹。

然后，选择要处理的特定扫描文件，并根据需要调整处理时间范围。单击“下一步”进入报告步骤。设置用于保存处理后文件的输出文件夹路径，并配置报告图像的可视化参数。

现在点击“运行”以开始处理数据。处理完成后，将生成一个包含定位微泡坐标的 TRK 文件，以及代表密度、速度和背向散射振幅的 TIFF 文件。将 TRK 文件加载到 IcoStudio 中，以开始探索已处理的数据。

然后，使用 IcoStudio 右侧面板调整对比度、压缩和色图等可视化参数，以增强数据呈现效果。设置积分时间时，调节主视图底部的双滑块，以定义分析的起始帧和结束帧。密度选项卡显示微泡出现的分布情况。

在绝对密度和方向密度之间进行选择。然后，单击“速度”选项卡，以绝对、方向、轴向和横向模式显示微泡速度，单位为毫米每秒。调整对比度、压缩和速度阈值，以提高图像清晰度。

然后浏览“背向散射振幅”选项卡，查看微泡的反射性，这可增强对比度，并揭示微血管结构和非平面运动。可将图像导出为高分辨率PNG格式，或生成TIFF文件用于定量分析，并可自定义像素大小。通过超分辨率定位显微镜（ULM）获取的大鼠脑冠状切片微泡密度图，不仅分辨出较大的血管，还清晰呈现了精细的毛细血管结构，揭示了包括分叉和分支模式在内的详细血管拓扑结构。

同一脑切片的速度图显示了清晰的轴向血流方向，其中向上的血流代表静脉引流，向下的血流对应动脉灌注，这与已知的皮层血管结构一致。后向散射振幅图提供了依赖深度的对比度，并根据血管的垂直位置突出显示血管，有助于分割出平面外或低振幅的血管。在同一小鼠中相隔一周获取的血管密度图显示出强烈的空间重叠，证实了利用脑部定位系统进行冠状面靶向的可重复性。

多次实验对左侧体感皮层的定量分析显示，血管半径、流速和流量分布相似，证明了测量结果具有可重复性。在左侧丘脑区域也观察到类似的可重复性，第一周与第二周实验之间的血管半径、流速和流量数值保持一致。本研究证实，超声定位显微技术能够可靠地在活体中生成微血管结构和血流的超分辨率图谱。

本方案填补了利用专用功能超声系统在活体啮齿类动物中实现可靠超分辨率定位显微镜（ULM）成像的标准化操作流程的需求。