利用流感病毒冷冻电子断层扫描技术解析血凝素的亚纳米级分辨率结构

本实验室利用结构生物学研究病毒及药物耐药性的进化。在当前的研究中，我们正在表征流感病毒血凝素在受体结合时构象变化的机制。我们采用冷冻电子断层扫描技术来可视化病毒的形态组织与结构。

具体而言，我们已采用这种冷冻电子显微镜技术对形态多变的流感病毒进行成像。本方案使我们能够在完整病毒颗粒上原位研究流感病毒血凝素的排列与结构，达到亚纳米级分辨率。这种更高分辨率使我们能够观察到以往难以察觉的相互作用。

首先，启动一个 Linux 终端以激活 Conda 环境。使用终端激活已安装 ISO net 的 Conda 环境。创建一个名为 tomo 文件夹的子文件夹，然后将所有断层图像文件移入该文件夹中。

接下来，使用代码在项目文件夹中生成一个 star 文件。使用文本编辑器打开生成的 star 文件，并将零度倾斜图像的近似离焦值输入到第四列中。现在在终端中运行 CTFD 卷积命令。

去卷积完成后，启动 EMAN2 图形用户界面环境，以开始进行颗粒挑选的预处理。在断层成像模块下，左键单击原始数据旁边的箭头，从下拉菜单中选择导入断层图，并选择相应文件。然后，左键单击分割旁边的箭头，选择预处理后的断层图。

使用合适的默认参数。预处理后，系统将自动创建一个 info 目录，其中包含与过程断层扫描文件基名相对应的空白 JSON 文件。在继续操作前，请向这些文件中添加埃米级像素信息。

为了训练卷积神经网络（CNN）以识别HA糖蛋白，需将工作目录更改为待使用断层图像所在的路径，然后通过终端打开CNN训练界面。确认已打开四个窗口。

一个包含目录中关于CNN参数和断层图像的信息，另外三个窗口分别显示CNN选出的良好参考图像、不良参考图像以及颗粒。在CNN图形用户界面中，单击新选项，以默认学习率0.0001和盒子尺寸八来初始化CNN。在文件名列中，左键单击一个代表性断层图像以打开它。

将光标悬停在打开的断层图像上，然后单击鼠标滚轮以打开新窗口。左键单击 N 数值滑块以沿 Z 轴进行浏览。接下来，在打开的断层图像上，使用“良好参考”面板选择 10 到 20 个对应于 HA 的特征。阳性图像将显示在阳性窗口中。

要移除一个，按住 Shift 键并单击左键。现在切换到不良参考图像面板，选择 10 到 20 个对应于空膜区域、核糖核蛋白密度、定位标记物和碎片等特征的参考图像。将迭代次数设置为 50，然后单击训练图标以开始 CNN 训练。

训练完成后，点击“应用”。选定的颗粒将以蓝色圆圈显示在断层图像上，或可在颗粒窗口中查看。通过选择更多的正负参考颗粒继续优化，并定期点击“保存”以保留进度。

当卷积神经网络（CNN）表现令人满意后，点击“应用全部”以执行颗粒挑选。随后在多个断层图上评估结果，并根据需要重新训练。要保存每个断层图的坐标，请使用命令 e2projectmanager.py 重新打开 EMAN2 图形用户界面（GUI）。

单击子断层平均图下方的箭头，然后选择手动框选。接着输入断层图的名称，再单击启动。随后依次单击文件、保存框选坐标和 tomogram_ha。

txt 文件以保存坐标。导航至神经网络子文件夹和 info 子文件夹，以备份并保存网络。hdf、trainouts。

hdf、segouts.hdf 和 boxes3Dref.hdf。通过将训练框大小从 8 更改为 14，训练第二个卷积神经网络以检测 M1 蛋白层和 VRNP 的存在。

为了筛选颗粒，首先从 GitHub 仓库下载笔记本文件。然后打开 CNN 颗粒筛选的 IPYNB 笔记本，并加载所需的模块。将 HA 和 M1 坐标文本文件加载到笔记本中。

使用开源3D库将它们以3D点云形式查看。接着，利用开源3D的统计离群值去除方法滤除HA坐标的离群点。然后，通过识别距离M1超过20个像素的HA点作为离群点，计算HA与M1点云之间的距离，并将剩余的坐标保存至输出文本文件中。

使用 pts2 star file.IPYNB 将所有颗粒合并并保存为 star 文件。利用 WarpTools 提取弯曲因子为四的颗粒，并使用该代码在 RELION minus four 中进行初始子断层平均。将 warp star 文件转换为 RELION four 格式。

然后，使用 RELION refine MPI 对部分粒子子集生成初始参考模型。利用 RELION refine MPI 对子断层图像进行 3D 自动精修。当达到收敛后，以 8 为 titan 平移偏移量、2 为步长，重复进行自动精修。

利用 RELION refine 进行二维分类，以剔除垃圾颗粒。使用代码创建包含优质类别的 star 文件，然后合并各个单独的 star 文件。代表性断层图像显示病毒颗粒具有多形性，形态从球形到长条形不等。

最终的亚断层平均图达到了6.0埃的全局分辨率，局部分辨率范围为5至7埃。在最终的HA重构图中，α螺旋和β折叠结构清晰可辨，表明精修后的结构图具有良好的结构质量。在HA头部和茎部的四个位置可识别出糖基化位点，证实最终重构图中可见糖链密度。