改进CAR T细胞中CRISPR-Cas9筛选：一种优化的文库构建方法

我们的研究重点是利用CRISPR筛选方法来鉴定靶点并提高CAR T细胞疗法的有效性。目前实验面临的挑战包括在CRISPR筛选方法中实现可重复的实验操作。首先，将预定量的Lentiviral CRISPR文库加入含有T细胞的24孔板中。

加入多聚脑（poly brain），终浓度为每毫升8微克。轻轻混匀以确保均匀分布。在32摄氏度下以700 ×g离心90分钟，进行旋转感染（spin-fection）。

离心后，小心地从离心机中取出培养板。更换为新鲜的T细胞生长培养基。六小时后，以感染复数为3的剂量加入CAR慢病毒载体。

将细胞在 37 摄氏度下孵育四天。孵育结束后，收集 CAR T 细胞，用 PBS 洗涤一次。

然后使用碘化丙啶-丫啶橙对细胞进行染色，并在荧光细胞计数器中计数。在电穿孔缓冲液中配制4 µM的Cas9溶液。将5 × 10⁶个CAR T细胞重悬于50 µL Cas9溶液中，重复五次。

然后将50微升细胞悬液移液至多孔比色皿条的每个孔中，避免产生气泡。若存在可见气泡，可用移液枪头轻轻沿孔壁划过以去除。使用expand T-cell three程序对CAR T细胞进行核转染。

将比色皿置于37摄氏度的培养箱中孵育40分钟。用T细胞生长培养基重悬核转染后的细胞，然后于37摄氏度再次孵育三天。

使用荧光细胞计数仪结合吖啶橙-碘化丙啶染色对细胞进行计数。将细胞密度调整至每毫升10的6次方个细胞后，加入嘌呤霉素，使其终浓度为2.5微克/毫升。孵育六天后，采用流式细胞术评估CAR阳性细胞的百分比。

然后分选CAR T细胞群体，并将干燥的细胞沉淀在-80摄氏度下保存。采用细胞和组织DNA提取方法从样品中提取基因组DNA。使用双链DNA定量试剂盒测定基因组DNA浓度。

接下来，在50微升的总体积中，用20单位所选的限制性内切酶消化最多五微克的基因组DNA。在37摄氏度的热循环仪中孵育过夜。第二天，准备10毫升洗脱缓冲液（含10毫摩尔Tris HCl）和50毫升新鲜的70%乙醇。

将100微升消化产物用移液器加入含有涡旋混匀的磁珠的离心管中。用移液器充分混匀悬浮液，室温孵育5分钟，然后置于磁力架上5分钟。在磁力架上时，弃去上清液，用移液器加入200微升70%乙醇溶液，注意不要扰动沉淀物。

30秒后，弃去上清液，再进行两次酒精洗涤。两次洗涤后，让磁珠干燥两分钟，然后将其从磁铁上取下。加入40 µL洗脱缓冲液，用移液器吹打重悬磁珠。

将悬浮液磁力分离两分钟，然后将上清液转移至新管中。向含有1毫克涡旋链霉亲和素磁珠的管中加入1×洗涤结合缓冲液。用移液器吹打使磁珠在缓冲液中重悬。

然后将悬液置于磁力架上1分钟，弃去上清液，并再进行两次洗涤。第三次洗涤后，将磁珠重悬于两倍体积的洗涤结合缓冲液中。随后，向纯化的消化产物中加入5 µL 10 µmol/L的生物素标记下拉引物。

将混合物在96摄氏度的干浴中孵育5分钟，随后立即在冰上冷却5分钟。向反应体系中加入1毫克预先洗涤过的链霉亲和素磁珠，确保反应液与链霉亲和素磁珠的体积相等。室温孵育20分钟，每隔4分钟重新悬浮一次。

将磁珠磁力吸附5分钟，然后用1×洗涤结合缓冲液清洗三次。最后，将含有结合sgRNA片段的磁珠重悬于50 µL洗脱缓冲液中。制备并扩增sgRNA文库，然后进行测序。

经过抗生素筛选后，用CRISPR文库转导的CAR T细胞在嘌呤霉素处理后，来自两个供体的细胞均表现出持续的存活和增殖。未转导的T细胞以及未转导CRISPR文库的CAR T细胞在抗生素筛选下未表现出类似的增殖，作为阴性对照。使用NDEL和PSPXI限制性内切酶消化可使基因组DNA片段化，同时保留单链向导RNA表达盒以进行富集。

随后选择性扩增了含有sgRNA的片段。Pearson和Spearman相关性分析表明，与质粒文库相比，供体基因组DNA样本中的单导向RNA读数数量和文库复杂性均得以保持。稳健秩聚合分析鉴定了在两个供体中经Cas9编辑后显著富集或耗竭的基因。

通路富集分析揭示了与已鉴定的遗传调控因子相关的主要基因本体论术语。本方案为利用CRISPR筛选方法的现有实验技术提供了一种可靠的替代方案。我们的研究结果将通过支持更可重复且更稳健的CRISPR筛选方案的开发，推动该领域的发展。

我们的研究结果为鉴定基因奠定了基础，并可通过调控来增强CAR T细胞的表型与功能。