从冻存的血沉棕黄层样本重编程诱导多能干细胞系
2026年4月10日
本方案详细介绍了针对患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导多能干细胞（iPSC）建系过程中难以按照制造商说明书进行重编程时的故障排除步骤。该方案主要适用于冻存的血沉棕黄层样本，但也可用于纯化的PBMC细胞的重编程。
本实验方案的目的是将人类冻存的血沉棕黄层或外周血单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞。该方案在解冻后对血沉棕黄层进行独特纯化，并鉴定出一种可指示重编程成功与否的体细胞形态特征。首先，取出源自人类血液的冻存血沉棕黄层，并置于冰上。
将样品在37摄氏度水浴中轻轻摇晃，当仅剩少量冰晶时取出小瓶。小心地将小瓶中的内容物逐滴转移至含有12毫升DPBS的锥形管中。用1毫升DPBS冲洗小瓶，并将冲洗液加入含有回收细胞的锥形管中。
使用水平转子，在室温下以 200 g 离心样品 10 分钟。小心吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于 4 毫升含 1% FBS 的 DPBS 中。接着，将血沉棕黄层混合物轻轻铺在 3 毫升密度梯度溶液之上，注意避免在界面处发生混合。
使用水平转子，在室温下以800 ×g离心20分钟，关闭刹车。用移液器小心吸除并弃去上层血浆层，注意不要扰动血浆与分离液的界面。然后吸取位于界面处的外周血单个核细胞（PBMC）层，并转移至一个新的15毫升离心管中。
通过加入三毫升扩增培养基，以200 ×g在室温下离心10分钟，洗涤外周血单个核细胞。小心吸去上清液，并将沉淀重悬于两毫升含有细胞因子（如SCF、IL-3、EPO和IGF-1）的扩增培养基中。将细胞接种至12孔板中的1个孔内。
将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳和20%氧气条件下培养10至14天。每隔一天更换一半培养基，直至观察到大量明亮、圆形的成红细胞，表明细胞已准备好进行转导。用携带Yamanaka因子的仙台病毒转导三天后，将细胞接种至小鼠胚胎成纤维细胞上，每孔2毫升。
将培养物孵育约七天，每隔一天用hESC培养基喂养新出现的克隆。将含有转导细胞及已出现克隆的培养板置于解剖显微镜下，利用显微镜定位一个待挑选的克隆，并掀开培养板盖子以暴露孔位。
无菌打开注射器，露出针头。在显微镜引导下，用针尖沿克隆边缘划线，将其从周围的饲养层细胞中分离。用针尖将克隆切割成若干大小相近的小块。
如果组织块尚未脱落，可用针的侧面将其从培养板上舀起或刮下，直至其悬浮于液体中。现在使用P200移液器，在显微镜下找到已挑选的菌落，用移液器吸取悬浮的菌落，并将其转移至预先准备好的24孔板的一个孔中。确保完整转移整个菌落，避免同时吸走其他菌落或饲养细胞。
将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和20%氧气的培养箱中培养，直至达到所需汇合度。选择体积较大、呈圆形且边缘发亮的克隆作为准备传代的克隆。吸除孔中的培养基，并用1毫升DPBS冲洗样品一次。
然后移除DPBS，并加入500 µL的0.5 mM EDTA解离缓冲液。将样品在37°C、5% CO₂条件下孵育2分钟，直至细胞集落松解且细胞变圆。接着，从培养箱中取出培养板，吸除EDTA解离缓冲液。
使用 P1000 移液器，加入一毫升人多能干细胞培养基，轻柔吹打直至细胞集落脱离并略微分散。将含细胞的一毫升培养基转移至新的六孔板中，该孔板内已预先加入一毫升新鲜的人多能干细胞培养基。将细胞置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳和 20% 氧气的培养箱中培养。
每天更换培养基以培养诱导多能干细胞，直至细胞长满培养孔并准备进行传代。同时，用7毫升在DPBS中配制的5微克/毫升纤连蛋白溶液包被一个10厘米培养皿，并在室温下孵育1小时。继续传代时，向该10厘米培养皿中加入7至10毫升人多能干细胞培养基，将六孔板中的细胞以1:1比例转移至培养皿中，并按照之前所示条件进行孵育。
在再次传代细胞前，确认10厘米培养皿中的细胞已达到汇合状态。根据细胞形态和密度调整传代比例，通常使用1:10的比例，并记录每次传代的代数。最后，通过免疫荧光检测NANOG表达，以鉴定诱导性多能干细胞的干性标志物。
使用特定的培养条件将细胞分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系。通过检测PAX6、Brachyury和SOX17的染色情况以及NANOG表达的消失来评估分化潜能。扩增结束时，外周血单个核细胞（PBMCs）分化为成红细胞，表现为大小不一的明亮圆形细胞。
缺乏这些细胞或出现死亡的培养物通常无法成功重编程。成功的转导和重编程表现为在经照射的饲养细胞上出现诱导性多能干细胞集落，并逐渐形成典型的干细胞形态。而未能获得类似干细胞形态的细胞则未被成功重编程。
成功重编程的诱导性多能干细胞呈现出致密、圆形的克隆集落，边缘光滑且明亮。通过调整传代条件，可清除形态欠佳的亚克隆，例如出现自发分化或中心过于致密的克隆。部分挑选的克隆未能成功扩增。
除了形态学特征外，诱导性多能干细胞还表现出干性，表现为干性标志物 NANOG 的表达。重编程获得的诱导性多能干细胞具有向外胚层、中胚层和内胚层分化的潜能。本方案提供了详细的检测节点，用于追踪和预测重编程的成功情况。
为了进一步确认iPSC细胞系是否适合使用，应进行核型分析、基因分型以及常规支原体检测。本方案可利用已有的患者群体及其生物样本库中保存的血沉棕黄层进行重编程，从而拓展iPSC技术的应用范围。
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概述
本文介绍了一种将人冻存的血沉棕黄层或外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的详细实验方案。该方法强调纯化步骤、形态学检测点以及故障排除策略，以最大限度提高重编程成功率，尤其适用于处理有限或珍贵的患者样本。
关键研究要素
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 再生医学
背景
- 人类多能干细胞（hPSCs）在疾病建模和个体化医学中至关重要。
- 诱导多能干细胞（iPSCs）可由成体体细胞生成，包括来源于血液样本的细胞。
- 血沉棕黄层和外周血单个核细胞（PBMCs）是易于获取且创伤最小的可重编程细胞来源。
- 现有的PBMC重编程方案在处理冻存的血沉棕黄层样本时常失败，因此需要对方案进行优化调整。
研究目的
- 提供一种可靠的方案，将冻存的血沉棕黄层和外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）。
- 识别可预测重编程成功的关键形态学和操作步骤检查点。
- 使研究人员能够利用生物样本库中的血液样本进行诱导多能干细胞的建立。
使用的方法
- 使用密度梯度离心法解冻并纯化冷冻的血沉棕黄层。
- 用细胞因子（SCF、IL-3、EPO、IGF-1）培养外周血单个核细胞（PBMCs），以扩增成红血球细胞。
- 利用携带山中因子的仙台病毒进行转导，实现重编程。
- 挑取克隆、扩增并对新生的诱导多能干细胞（iPSC）克隆进行形态学评估。
- 通过NANOG免疫荧光染色及三系分化能力检测对诱导多能干细胞（iPSCs）进行表征。
主要结果
- 重编程成功的标志是出现致密、圆形的诱导性多能干细胞（iPSC）集落，具有光滑且明亮的边缘。
- 扩增后出现明亮、圆形的成红细胞，可预测重编程潜能。
- iPSC集落表达多能性标志物（例如，NANOG），并可分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系。
- 形态欠佳的亚克隆可通过调整传代条件加以改善。
结论
- 本方案可实现将冻存的血沉棕黄层和外周血单个核细胞可靠地重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）。
- 详细的质控节点和故障排除步骤提高了实验成功率，即使对于难处理的样本亦如此。
- 该方法拓展了iPSC技术在生物样本库储存样本及有限患者样本中的应用范围。
常见问题
行业重要性概述
从冷冻的血沉棕黄层样本中重编程诱导性多能干细胞（iPSCs），可获得宝贵的患者来源细胞模型，用于疾病研究和个体化医疗。本方案解决了从生物样本库保存或有限量血液样本中可靠生成iPSCs的技术难题，支持转化研究的连续性，并提高早期发现阶段的预测可信度。该方法通过拓展存档生物样本在靶点验证和机制研究中的应用，增强了研究项目的灵活性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够生成患者特异性的诱导多能干细胞系，用于基于假设的疾病建模。
- 通过提供基因背景相关的细胞系统，支持功能靶点的验证。
- 通过谱系分化和标志物分析，促进作用机制的去风险化研究。
- 允许对来自不同参与者的样本进行直接比较，从而提高预测的可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游检测开发提供标准化且可扩展的诱导多能干细胞系。
- 通过重编程过程中的形态学和分子检测点确保可重复性。
- 实现对分化和干性标志物的定量评估，以确认检测准备就绪状态。
- 通过适应有限或珍贵样本输入，支持可扩展的工作流程。
转化与临床前研究
- 将诱导多能干细胞衍生模型与疾病相关表型对齐，用于转化生物标志物研究。
- 利用生物样本库中的患者样本，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过体外确认多能性和分化潜能，降低生物学风险。
- 基于稳健的细胞表征，支持进行风险调整后的推进决策。
流程与工作流整合
本方案通过利用存档血液样本建立诱导多能干细胞（iPSC），融入从发现到临床前研究的连续流程，支持靶点验证、检测方法开发及转化医学研究。
- 发现生物学：利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）促进假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、质量可控的iPSC细胞系，用于检测标准化。
- 分析：通过干性及分化标志物分析提供定量读出结果。
- 转化研究：将生物样本库中的样本与疾病相关的细胞模型相连接，以实现生物标志物的匹配。
- 企业级复用：提升现有生物标本库在多个研发项目中的价值。
运营与企业影响
- 科学价值：提高疾病建模的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化重编程与质量控制流程，实现可重复的诱导多能干细胞（iPSC）生成。
- 战略价值：利用存档样本，支持更优的立项/终止决策，提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的发现阶段资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备干细胞培养、重编程及形态学评估方面的专业知识。
- 需要具备细胞培养设施、免疫荧光以及分子表征工具的使用条件。
- 要求跨团队对检测节点和质量控制实验进行标准化。
- 可适用于富集白细胞层和外周血单个核细胞来源，必要时可对方案进行调整。
- 依赖于样本的质量与可获得性，需针对困难样本准备相应的故障排除策略。
