利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

我们研究细胞衰老及其特征，重点关注溶酶体变化等特征如何作为衰老的标志物。传统的衰老标志物通常是基于终点且为二元判断的，而活细胞成像则能够在不同条件下将衰老表现为连续的定量信号。首先，将IMR-90成纤维细胞接种于24孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育，直至形成亚汇合的单层细胞。

记录每次实验的接种密度以及铺板至溶酶体染色之间的时间。将完全培养基预热至 37 °C。用培养基配制 75 nmol/L 的 LysoTracker Deep Red 工作液，并避光保存。

通过轻柔倒置混合工作液。选用采用明确的衰老诱导方法制备的匹配的近衰老期和衰老期 IMR-90 成纤维细胞群。通过监测生长特征和形态来确认衰老表型。

吸弃每孔中的旧培养基。沿每孔孔壁轻轻加入LysoTracker工作液，避免扰动单层细胞。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中与LysoTracker共孵育30分钟。

在 LysoTracker 孵育的最后 10 分钟，将 Hoechst 33342 直接加入孔中，终浓度为厂家推荐的工作浓度，并通过轻轻摇动培养板混匀。孵育结束后，移除染色液，并用预热的 PBS 轻柔冲洗细胞一次，以降低背景荧光。冲洗后立即加入预热的无酚红培养基。

直接进行活细胞成像，保持所有孔从缓冲液更换到数据采集的时间一致。在培养板中对平行孔进行标记，用于β-半乳糖苷酶染色，以比较高衰老细胞与前衰老对照组。在固定前完成验证孔的活细胞成像。

在活体成像期间记录显微镜载物台坐标，以便在固定后重新定位相同的视野。加入衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒中的固定液，其中含有2%甲醛和0.2%戊二醛，处理细胞。用盖子盖好培养板，在室温下孵育10至15分钟。

移除固定剂，并用 PBS 洗涤孔板两次。然后向每孔加入含 X-gal 底物、pH 为 6 的 β-半乳糖苷酶染色液。用 Parafilm 封膜以减少孵育过程中的蒸发，并将孔板置于 37 °C 的无二氧化碳干燥培养箱中孵育 12 至 16 小时。

固定和染色后，将培养板置于显微镜载物台上，利用记录的载物台坐标重新定位相同的成像区域。在明场显微镜下观察各孔，并记录染色模式。为每种条件采集具有代表性的图像，并计算每孔中衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例。

衰老细胞显示出明亮且空间扩展的核周溶酶体富集区域，而衰老前对照细胞则整体信号较弱，呈现离散的点状结构。衰老条件下β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例高于衰老前对照组。在重复孔之间，LysoTracker荧光强度与衰老相关β-半乳糖苷酶阳性区域之间表现出强相关性。

在衰老细胞培养物中，阳性掩膜内的平均LysoTracker强度高于前衰老细胞培养物，使其成为区分这两种状态最可靠的基于视野水平的判别指标。在所示的代表性视野中，衰老细胞培养物中每个细胞核的总LysoTracker强度也更高。本方案使研究人员能够测量活细胞中溶酶体的重塑过程，提供一种可量化的单细胞读数，用于评估衰老负担及其进展。

在所有孔之间保持染色和成像设置的一致性非常重要，因为强度比较仅在同一实验批次内有效。未来的研究可将此方法扩展至三维模型、其他细胞类型，并在不同的显微镜系统和工作流程中进行验证。