微施用器辅助感染鳞翅目幼虫的杆状病毒实验方案

尽管杆状病毒是一种仅感染节肢动物的病毒，被广泛用作真核蛋白表达系统的标准研究工具，但它也正在被开发为一种环境安全的杀虫剂，可在自然条件下杀死鳞翅目等植食性昆虫。鳞翅目幼虫通过取食被感染的植物叶片而感染杆状病毒。幼虫或毛虫以一种称为多面体的形式摄入杆状病毒，多面体是由大量晶体状蛋白质结构包裹病毒粒子形成的复合物，可保护病毒免受干燥环境的影响。

幼虫感染后，病毒在昆虫体内扩散感染。该病毒劫持宿主的核酸和蛋白质合成系统，以产生更多的病毒粒子和多面体。最终，幼虫被病毒彻底感染，溶解成含有大量多面体的黏稠液滴，滴落在昆虫取食的植物表面，从而启动新一轮感染循环，以此评估特定Baca的杀虫效果。

可以将Avir菌株微量施用技术与生物测定相结合。通过将杆状病毒直接注射到血淋巴或体腔中，可感染Leid dorin幼虫，并可评估其死亡率。此外，可利用口服微量施用辅助注射法，使幼虫感染多面体包涵体，并可检测肠道及其他组织的感染时程。

大家好，我是 Wendy Sparks，来自爱荷华州立大学昆虫学系 Brian e boning 的实验室，同时也来自 boning snap。今天我们将向您展示两种用 backlog 病毒感染实验室果蝇 DI 的实验方法。这两种方法均使用显微注射仪。

首先，我将向您展示如何使用微量移液器通过前列腺将病毒颗粒注入小鼠的精囊。然后，我将向您展示如何使用微量移液器通过小鼠的尿道将多聚头蛋白注入膀胱。现在我们开始吧。

在开发用于杀虫目的的杆状病毒时，通常会包含多面体基因，以促进对害虫幼虫的经口感染。然而，有时出于测试无多面体的杆状病毒是否具有潜在杀虫效果，或需要绕过昆虫肠道的目的，可采用微量施用器注射裸露病毒的方式，在开始实验前直接感染幼虫。

应通过噬斑实验或终点稀释实验测定工作储备病毒的滴度。在生理学实验中，通常向每头五龄H VNS幼虫注射5 × 10⁴ PFU的病毒量。开始本生物测定前，将每种稀释度的病毒液分别加入塑料1 cc Hercule注射器中，并配备28.5或32号锐利针头。

通常使用一到三微升的浓缩病毒溶液，滴度为每毫升10的7次方至10的8次方，每头幼虫使用该剂量即可。向注射器中装入300至500微升通常足以满足大多数实验需求。接下来，将注射器垂直向上持握，使气泡上升至针尖，从而排出注射器中的气泡并进行排液。

然后将注射器固定到注射器支撑管上。现在将体积设为1.0微升。对于微量点样器微处理器控制单元上的每个液滴，首先校准控制单元，以确保准确分配出设定体积，液滴的分配速度可在0到9的范围内进行设置。

通常使用 0 到 1 的范围。踩下脚踏开关，以确保溶液被适当分配。请注意，如果分配的溶液体积过大或施加速度过慢，可调整体积和速度设置，直至在正确速率下施加适量的溶液。

现在我准备开始进行 H VNS 感染的注射。通常选择早期五龄幼虫进行注射，因为后期幼虫体型较大，更便于注射操作。将针尖穿过一条前足的基节部位，插入体腔内。

注意，当针尖插入幼虫时，调整幼虫体位以避免损伤肠道和体壁。此时按压脚踏开关四次，将四微升病毒溶液注入血腔。注射完成后，将所有幼虫放回28摄氏度的培养箱中。定期检查死亡的幼虫，并确保存活幼虫有充足的食物供应。

尽管高龄幼虫因注射导致体壁受损后不会死亡，但仍应在注射后24小时检查幼虫，以防肠道受到损伤，这种损伤可能由细菌感染引起。早期死亡个体应从数据分析中剔除。若使用微施用器辅助的生物测定法结合钝化病毒进行致死浓度生物测定，则应在不同时间重复实验三到四次。

每种病毒或对照处理组使用每个剂量30个个体。使用适当的概率分析程序（如Polo或SAS）计算LC50值、95%置信区间及相关统计参数。该生物测定也可用于在接种固定剂量病毒后测定ST50生存时间值。

在此情况下，应每四到八小时记录一次幼虫死亡率，并进行更频繁的观察。若死亡率较高，则使用Kaplan-Meier估计法，通过S-Plus或SAS程序计算95%置信区间内的中位生存时间。现在，Harran已向您演示了使用杆状病毒的微量点样辅助生物测定方法。

我将为您演示该检测方法。当感染的精确时间至关重要时，可采用多面体直接经口接种的方式将其引入昆虫肠道。例如，在监测病毒在昆虫体内扩散过程时，可开始此检测：将多面体悬浮于中性浮力的甘油与水按3:2比例配制的溶液中，浓度范围为每毫升10至300个。

例如，可使用多面体用于四龄幼虫的处理。然后将该溶液装入带有32号钝头针头的塑料或玻璃1 CC结核病注射器中。将注射器置于显微操作仪的支撑管上，并在显微镜下观察。

握住四龄或五龄星虫幼虫，将针头从口部插入中肠的前部，然后注入多面体病毒。该技术需要一定的练习。首先，戴手套操作时很难在不压碎幼虫的情况下将其固定住。

其次，将针头穿过口器部分需要一定的练习。我们建议先用 PBS 接种约 30 头幼虫进行练习。如果意外刺破肠道，幼虫会迅速变黑，这一现象将非常明显。

同样，由于微量点样器辅助的口服接种能够提供精确的感染时间，因此该方法在需要确定病毒感染在昆虫体内扩散过程的实验中最为有用。例如，可将表达β-半乳糖苷酶的病毒通过口服方式接种至幼虫，随后在不同时间点解剖幼虫，以确定哪些组织在何时被感染。我们仅向您展示两种使用微量点样器辅助进行感染的方法。昆虫感染病毒的第一种方法是通过后足节间膜直接接种病毒，该方法可绕过肠道生理屏障，从而评估所研究病毒的致死性及致死时间。

第二种技术是使用多面体通过直接接种至中肠。该方法可将非常精确剂量的病毒直接递送至中肠，同时能够精确控制感染发生的时间点。随后，您还可以研究病毒导致的死亡率及其他表型特征。

进行此操作时，需注意被巴乌拉病毒杀死的虫体通常较为脆弱，容易破裂并释放病毒。因此，必须对工作台面进行消毒，并妥善处理受污染的手套和一次性材料，以防止污染。以上就是全部注意事项。

感谢观看。祝您的实验顺利。