利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白
2021年7月17日
杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种强大的平台，可用于表达筛选和生产蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs），以用于生化、生物物理和结构研究。对于大多数PRMTs及其他需要真核表达平台的目标蛋白，均可产生毫克级的材料。
本实验方案的总体目标是，在表达平台S（杆状病毒表达载体系统）的支持下，以成本效益较高的模式进行大规模生产，对多种蛋白精氨酸甲基转移酶构建体进行表达筛选，从而获得毫克量级的蛋白质，用于生化、生物物理及结构研究。Alma Seitova 博士将演示以下步骤：将处于指数生长期的 SF9 细胞用无血清昆虫培养基稀释至终浓度为每毫升 0.4 × 10⁶ 个细胞，并倒入无菌试剂储液槽中。
使用可编程多通道移液器将0.5 mL稀释后的SF9细胞接种到24孔板的每孔中。此体积足以确保细胞均匀覆盖孔板的工作表面，同时不会过度稀释转染混合物，从而保证转染效率。
将培养板中的一个孔标记为“仅细胞”，并将其用作对照，以比较转染与未转染细胞，评估是否存在潜在的感染迹象。将培养板在27°C条件下孵育至需要时，约一小时，使细胞贴附于细胞培养板上。在无添加物的昆虫培养基和无菌试剂储液槽中稀释充分混匀的转染试剂，并轻轻混匀10秒。
使用12通道移液器，将102微升稀释后的转染试剂转移至无菌的96孔MicroWell板中。向96孔MicroWell板的相应孔中加入10微升浓度为0.2微克/微升的重组bacmid DNA，并通过轻轻摇动或从侧面轻弹平板进行混匀。将转染混合物于室温孵育15至20分钟，以形成复合物。
使用专为在96孔板和24孔板之间转移液体而设计的可调式六通道移液器，将转染混合物逐滴加入转染板相应孔中的细胞上，并在27摄氏度下孵育4小时。为确保转染混合物在细胞单层上均匀分布，在孵育期间应轻轻前后摇动培养板数次。转染后4至5小时，加入1.5 mL无血清昆虫细胞培养基。
加入终浓度为10%的热灭活胎牛血清和1%的抗生素-抗真菌剂。将细胞在27°C培养箱中培养72至96小时。在可能的情况下，每天轻轻摇动转染板一次。
在转染后72至96小时观察转染细胞中明显的感染迹象。转染后四到五天，在倒置显微镜下，与对照细胞相比，转染细胞中应可观察到明显的感染迹象，且初始重组杆状病毒已分泌至细胞培养基中，可进行收集。使用可编程电子多通道移液器，同时收集P1代病毒，并用150微升P1代病毒感染新接种的SF9细胞，进行悬浮细胞的感染，操作在24孔板中进行。
将剩余的全部P1病毒储备液在15分钟内离心沉淀，用感染的SF9细胞悬浮培养物覆盖24孔板，并用AirPore膜密封。将24孔板置于27°C、245 rpm振荡条件下培养72至96小时。在预定生产时间前四天，将处于指数生长期的SF9细胞以每毫升200万个细胞的终浓度接种于含1%终浓度抗生素和抗真菌剂的无血清昆虫培养基中，使用带挡板的锥形玻璃摇瓶进行传代培养。
此步骤将产生含有感染昆虫细胞和上清液中P2病毒的悬浮培养物，用于后续生产批次中对新细胞的感染。加入相应的P2病毒，将感染后的细胞在25摄氏度的较低温度下孵育，以减缓细胞生长，并在轨道摇床（振幅1英寸）上以165 RPM的速度振荡培养。在预定生产时间前四天，将处于对数生长期的两升SF9细胞接种至昆虫无血清培养基中，细胞密度为每毫升100万个细胞，使用2.8升的Fernbach摇瓶进行培养。
在27摄氏度、150 RPM的振荡条件下摇动烧瓶。研究人员Ashley Hutchinson将演示以下实验方案。将四升指数生长期的SF9细胞与无血清昆虫培养基混合，分装至大的五升试剂瓶中，最终细胞密度为每毫升400万个。
加入10至12 mil的杆状病毒感染昆虫细胞的悬浮培养物。将感染的SF9细胞培养物置于摇床中，在25摄氏度的较低温度下以145 RPM振荡培养72至96小时。如图五所示，可在SF9细胞中利用杆状病毒瞬时表达系统表达PRMT家族的多种重组蛋白，获得毫克级产量，用于生物化学与生物物理的教学研究。
在 SGC，已解析并存入蛋白质数据库（Protein Data Bank）的晶体结构包括蛋白质 PRMT4、6、7 和 9 的全长或截短形式，以及它们与多种化学探针和抑制剂结合的结构。这些 PRMTs 的表达质粒已由 SGC 存入基因文库，并向科研界开放获取。在本视频中，我们重点介绍了利用杆状病毒表达系统进行大规模生产时，对多种蛋白精氨酸甲基转移酶构建体成功开展实验筛选的关键要素。
使用常规的可调节和可编程多通道移液器，使整个操作过程比以往更加迅速且高效。采用对细胞高效且细胞毒性较低的转染试剂来生成重组病毒，使得该细胞处理转染方案更具成本效益。利用悬浮培养的杆状病毒感染六种细胞的大规模批次进行蛋白生产，显著减少了耗时的活体起始扩增步骤所需的人力。
例如，将感染细胞与特殊培养物一起进行离心。这当然排除了对感染细胞的额外操作，以避免病毒在更严格的条件下发生降解。悬浮培养细胞的维持在此类放大生产中，借助培养容器中较高的培养液体积，帮助我们克服了生产规模的限制，并实现了大规模生产平台的建立。
这对于无法获得生物反应器或生产流程中空间有限的实验室具有重要价值。尽管本方案已针对蛋白质精氨酸甲基转移酶家族的蛋白质进行描述，但该方法同样适用于其他任何需要表达平台以获得足够数量蛋白质用于生物化学与生物物理教学研究的蛋白质家族。
概述
杆状病毒表达载体系统（BEVS）是表达筛选和生产蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）的有效平台。该方法可用于制备毫克级的PRMTs，以开展多种生物化学、生物物理及结构研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 结构生物学
背景
- PRMTs 在细胞过程中发挥关键作用。
- BEVS 是一种广泛使用的真核表达系统。
- 高效蛋白质生产对研究至关重要。
- 深入研究通常需要毫克级的蛋白量。
研究目的
- 筛选多种PRMTs构建体以进行大规模生产。
- 获得足量蛋白质用于各类分析。
- 利用BEVS优化表达过程。
使用的方法
- 用重组杆状病毒DNA转染SF9细胞。
- 在受控条件下培养细胞。
- 从细胞培养基中收集重组杆状病毒。
- 使用可编程多通道移液器以提高效率。
主要结果
- 成功表达多种PRMT构建体。
- 产生毫克级蛋白质用于分析。
- 已优化转染和感染方案。
- 对BEVS平台效率的关键见解。
结论
- BEVS 是一种用于蛋白质生产的强大系统。
- 高效的实验方案可显著减少劳动量和时间成本。
- 该研究为未来关于 PRMTs 的研究提供了框架。
常见问题
行业重要性概述
高效生产毫克级重组PRMT蛋白对于生化、生物物理及结构研究至关重要，这些研究是早期药物发现和靶点验证的基础。杆状病毒表达载体系统（BEVS）能够实现可扩展的高质量蛋白生成，支持在临床前研究中进行机制层面的风险评估并提高预测可信度。该工作流程解决了在全项目范围内进行靶点探索和检测方法开发时蛋白质供应的瓶颈问题。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可实现多种PRMT构建体的制备，用于功能与机制研究。
- 通过提供充足的蛋白质支持通路解析，助力生物学层面的风险评估。
- 凭借稳定可靠的蛋白质供应，提高靶点选择的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的重组蛋白，用于下游生化和生物物理检测。
- 标准化蛋白表达流程，确保可重复性和可扩展性。
- 制备适用于高通量筛选平台的即用型蛋白批次。
转化与临床前研究
- 支持结构研究，为抑制剂设计和转化生物标志物的对接提供依据。
- 通过支持结构-功能分析，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过确保转化研究中蛋白质的质量与数量，降低靶点推进过程中的风险。
流程与工作流整合
这种基于杆状病毒表达系统的蛋白质生产方法贯穿从早期发现到先导物鉴定及临床前研究的全过程，支持迭代的假设验证和检测方法开发。
- 发现生物学：为机制和通路研究提供高质量的PRMTs。
- 筛选：支持可重复、定量的蛋白质批次生产，用于检测方法开发。
- 分析：为比较性生化和结构分析提供一致的蛋白质输入材料。
- 转化研究：支持基于结构的抑制剂开发及生物标志物研究。
- 企业级复用：提供可扩展且灵活的平台，适用于PRMT以外的多种蛋白质靶点。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化、可扩展的工作流程，简化蛋白质生产过程。
- 战略价值：减少蛋白质供应瓶颈，加快决策进程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：实现多靶点并行的风险调整优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备昆虫细胞培养和杆状病毒操作的专业知识。
- 需要可编程多通道移液器和可控培养箱基础设施。
- 要求跨团队标准化，以确保不同蛋白构建体之间的可重复性。
- 适用于具有相似表达需求的多种蛋白家族。
- 对于无法使用大规模生物反应器的实验室而言，具有空间效率优势。
