Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Hallo, mein Name ist Brad Hamilton. Ich arbeite in der Forschungs- und Entwicklungsabteilung von STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man induzierte pluripotente Stammzellen aus embryonalen Mausfibroblasten erzeugt.

Dieses Verfahren kann sowohl zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen als auch zur Untersuchung des Reprogrammierungsprozesses verwendet werden. Beginnen wir also. Impfen Sie zunächst murine embryonale Fibroblasten, oder MEF-Zellen, auf eine 15 cm große, mit Gelatine beschichtete Petrischale mit einer Dichte von 4 × 10⁵ Zellen pro Schale aus.

Geben Sie nun 30 Milliliter Meth-Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis sie etwa zu 80 % konfluent sind. Anschließend das Medium abziehen und 30 Milliliter Wachstumsmedium, ergänzt mit konzentriertem Lentivirus, hinzufügen.

Bewegen Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums sicherzustellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis die virale Transduktion abgeschlossen ist. Fahren wir nun mit der Doxycyclin-induzierten Umprogrammierung fort.

Um die Reprogrammierung zu beginnen, 20 bis 24 Stunden nach der Transduktion, wird Trypsin auf die transduzierten Zellen gegeben und diese bei 200 ×g fünf Minuten lang zentrifugiert. Danach wird das Medium vorsichtig vom Zellpellet abgesaugt und die Zellen in Wachstumsmedium resuspendiert. Sobald sie suspendiert sind, werden die transduzierten Zellen in einer geeigneten Konzentration entsprechend der Größe der verwendeten Zellkulturplatte ausgesät.

Hier verwenden wir 2,5 × 10⁵ Zellen pro 10 cm-Platte für Experimente zur Reprogrammierungseffizienz und zur Isolierung von iPS-Kolonien sowie 2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 4-Well-Platten für immunzytochemische Experimente. Zur Überwachung der Transduktionseffizienz inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen bei Bedarf in flüssigem Stickstoff eingefroren und für zukünftige Analysen aufbewahrt werden.

Am nächsten Tag das Medium abziehen und durch frisches Wachstumsmedium ersetzen, das mit Doxycyclin auf eine Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter ergänzt wurde. Wir verwenden eine negative Kontrolle mit Medium ohne Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen abschließend bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wir haben den Reprogrammierungsprozess eingeleitet. Im Allgemeinen werden pluripotente Stammzellkolonien nach 16 bis 22 Tagen groß genug sein, um sie isolieren zu können.

Bevor wir dieses Verfahren demonstrieren, müssen wir zunächst die Transduktionseffizienz mithilfe chemischer Methoden überprüfen, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen. Die immunchemische Analyse wird an den Zellen durchgeführt, die 48 Stunden nach der Doxycyclin-Induktion in Vier-Well-Platten erneut ausgesät wurden. Alle in diesem Protokoll angegebenen Volumina sollten entsprechend der Größe der Zellkulturplatte angepasst werden; beginnen Sie damit, die Zellen vorsichtig zu waschen.

Einmal mit PBS ohne Magnesium- oder Calciumionen waschen, anschließend die Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten fixieren. Bei Raumtemperatur die Zellen erneut vorsichtig zwei Mal mit PBS waschen. Danach die Zellen permeabilisieren, indem 500 µL kalte 0,2 %ige Tween-20-Lösung in PBS hinzugefügt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird.

Nachdem die Zellen zwei weitere Male gewaschen wurden, 200 Mikroliter Blockpuffer eine Stunde bei Raumtemperatur hinzufügen, um eine unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Nun 200 Mikroliter des gewünschten primären Antikörpers hinzufügen.

Hier verwenden wir die Pluripotenzmarker T 4K LF vier, SOX zwei und cmic. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag. Nachdem Sie die Zellen zwei Mal vorsichtig mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern Sekundärantikörper, wobei Sie die Platten vor Licht schützen.

Hier verwenden wir geeignete sekundäre Antikörper, die mit Fluorophoren konjugiert sind, zur Visualisierung mithilfe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen noch zweimal und geben Sie anschließend DPI zu, gefolgt von einer erneuten 10-minütigen Inkubation zur Visualisierung der Zellkerne. Schließlich, nach einem letzten Waschschritt, geben Sie Antifade-Aqua-Mount-Medium hinzu, bevor Sie die Zellen mit dem invertierten Fluoreszenzmikroskop aufnehmen, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.

Beginnen Sie die Isolierung und Expansion pluripotenter Stammzellen. Nach Einleitung des Reprogrammierungsprozesses überwachen Sie die Kulturen täglich und erneuern das entsprechende Medium alle 48 Stunden. Wir verwenden ein mit Doxycyclin supplementiertes Medium, um die Zellen während der ersten 12 Tage zu kultivieren, und entfernen anschließend das Doxycyclin aus dem Medium.

Die manuell zur Expansion ausgewählten induzierten pluripotenten Stammzell- oder IPS-Kolonien enthalten Doxycyclin. Unabhängige Zellen sollten täglich auf morphologische Veränderungen überwacht werden, die auf den Reprogrammierungsprozess hinweisen. Jedes Experiment unterscheidet sich, aber die Kolonien sind in der Regel groß genug für die Isolierung zwischen 16 und 22 Tagen nach der DS-Induktion, am Tag vor Beginn des Isolierungs- und Trypsin-Prozesses für reprogrammierte Kolonien.

Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie sie mit einer gamma-irradierten Füttererschicht aus Mets mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Well besiedeln. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag pflücken Sie jede IPS-Kolonie manuell und setzen sie durch Trypsinisierung auseinander, um die Zellaggregate zu dissoziieren; geben Sie die IPS-Zellen in einzelne Vertiefungen der vorbereiteten 24-Well-Platte in Maus-embryonalen Stammzell-Medium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden. Überwachen Sie die IPS-Kolonien täglich auf Wachstum und GFP-Fluoreszenz. Wir inkubierten unsere Kulturen sechs Tage lang, bevor wir sie zur Pluripotenzanalyse in Vier-Well-Platten verpackten.

Bestimmen Sie, welche Vertiefungen der 24er-Rundplatte gleichmäßig GFP exprimieren. Vertiefungen mit guter GFP-Expression können abgelöst, verdünnt und im Verhältnis 1:8 in Vier-Well-Platten überführt werden, die zuvor mit gamma-irradierten Füttererschichten aus mes beschichtet wurden. Diese Platten können dann für die ICC-Analyse der Pluripotenz verwendet werden, um die Pluripotenzanalyse zu beginnen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS, das keine Magnesium- oder Calciumionen enthält.

Fügen Sie 0,5 Milliliter pro Vertiefung kalte 0,2 % zwischen 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang. Nach drei weiteren Waschungen in PBS blocken Sie die unspezifische Bindung mit 200 Mikrolitern Blockpuffer eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Geben Sie nun 200 Mikroliter des gewünschten primären Antikörpers hinzu.

Hier verwendeten wir SSEA, einen Nanog- und OCT-Faktor, um die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Nachdem die Zellen vorsichtig zweimal gewaschen wurden, inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern sekundärem Antikörper, wobei sie vor Licht geschützt werden müssen. Wir verwenden hier die geeigneten sekundären Antikörper, die mit Fluoro Force konjugiert sind, zur Visualisierung mittels eines invertierten Fluoreszenzmikroskops. Nach zwei weiteren Waschschritten fügen Sie DPI hinzu und inkubieren die Zellen 10 Minuten lang.

Nach einem abschließenden Waschschritt antifa aqua mount hinzufügen, bevor die Zellen mit dem invertierten Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. IPS-Kolonien können außerdem mithilfe kommerziell erhältlicher Kits auf ihre alkalische Phosphatase-Aktivität hin analysiert werden. Mit dem stem gent docs inducible mouse TF Lentivirus-Set lässt sich MES nach Transduktion in IPS-Zellen umprogrammieren, wobei die Expression der Transkriptionsfaktoren induziert wird.

T vier, SOX zwei, KLF vier und Seic können in Zellen nach Behandlung mit Doxycyclin nachgewiesen werden, während in unbehandelten Zellen wenig oder keine Expression detektiert werden kann. Morphologische Veränderungen schreiten im Zeitverlauf fort und führen zur Bildung größerer, ES-Zell-ähnlicher Kolonien mit definierten Kolonierändern und dreidimensionalem Wachstum. Nach Entfernen von Docs ist bei einigen ES-Zell-ähnlichen Kolonien eine deutliche Rückentwicklung der zellulären Morphologie erkennbar.

Jedoch behielten viele der Kolonien ihre IPS-Morphologie bei. Diese IPS-Kolonien zeigen nach dem Auspflanzen und Passagieren eine typische Expression der Pluripotenzmarker alkalische Phosphatase, Nano T vier und SSEA eins.

Die in diesem Experiment verwendete Art von Meth-Zellen exprimierte GFP aus dem endogenen nag-Locus. Bei der Umprogrammierung in den Pluripotenz-Zustand kann daher die GFP-Expression als vorläufiger Indikator für eine erfolgreiche Umprogrammierung dienen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Umprogrammierung von embryonalen murinen Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mithilfe eines vierfaktoriellen, Doxycyclin-induzierbaren, antiviralen Systems auslöst.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass bei der Planung von Reprogrammierungsversuchen mehrere Variablen berücksichtigt werden sollten, um die Effizienz der Reprogrammierung zu optimieren. Erstens kann das Verhältnis zwischen aktiven Viren und Zielzellen während des primären Infektionsschritts angepasst werden, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen oder zu verringern, wodurch die Anzahl integrierter Viren in der Zielzellpopulation beeinflusst wird. Zweitens kann die Anpassung der Dauer, über die die Zellen Docs ausgesetzt sind, die Anzahl der erzeugten iPS-Kolonien beeinflussen.

Drittens kann die proliferative Kapazität der Zielzellen die Reprogrammierung beeinflussen, da Zellen, die aktiv wachsen und sich teilen, für die Reprogrammierung besser geeignet sind. Zuletzt wird empfohlen, bei der Anpassung des Protokolls an unterschiedliche Zellzahlen oder Kulturschalen unterschiedlicher Größe die Anzahl der Zielzellen proportional zur Oberfläche der Kulturschale anzupassen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.