Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Das Protokoll zeigt, wie man menschliche induzierte pluripotente Stammzellen effizient aus vier Millilitern peripheren Blutes erzeugt. Am Tag null isolieren und vermehren Sie die mononukleären Zellen aus der Probe mit peripherem Blut. Transduzieren Sie die primären Zellen mit dem Reprogrammierungs-Stammko-Vektor.

Am neunten Tag die transduzierten Zellen auf inaktivierte, embryonale Mausfibroblasten ausplattieren und etwa drei Wochen lang kultivieren. Kolonien, die HES-Zellen ähneln, zur Expansion und Charakterisierung auswählen. Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung zur Expression von Pluripotenzmarkern wie SS EEA vier, Trail eins 60 und Trail 180 1.

Veranschaulichen Sie die effiziente Erzeugung induzierter humaner pluripotenter Stammzellen. Die Verwendung des stammzellenspezifischen antiviralen Vektors zur Erzeugung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen bestehenden Methoden. Am überzeugendsten ist wohl die Gesamteinfachheit des Ansatzes, da dieser nur den einfachen Zugang zu Spendergewebe erfordert, und damit meine ich leicht erhältliche Proben peripheren Blutes.

Die wichtigsten Merkmale dieser Methode sind die Effizienz der Reprogrammierung und die Qualität der erhaltenen iPS-Zellklone. Die Durchführung der Prozedur wird Andrea January Summer, eine Postdoktorandin in meinem Labor, und Sarah Rozelle, eine Doktorandin im Labor von George Murphy, am Tag null demonstrieren.

Entnehmen Sie vier Milliliter peripheres Blut in ein Vakuumröhrchen für die Zellpräparation mit Natriumcitrat. Drehen Sie das Röhrchen innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme acht bis zehn Mal um. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.800 G für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die mononukleären Zellen zu gewinnen.

Aspirieren Sie das Plasma ab und pipettieren Sie den Buffy-Coat, die Zellschicht zwischen der Gelbarriere und dem Plasma, ab. Überführen Sie den Buffy-Coat in ein steriles kegelförmiges 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen mit steriler PBS auf 10 Milliliter ein. Invertieren Sie die Röhrchen mehrmals und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 300 ×g.

Suspensionieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter steriler PBS, führen Sie eine Zellzählung durch und überführen Sie anschließend ein- bis zweimal 106 Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Expansionsmedium. Impfen Sie die isolierten mononukleären Zellen dann in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte aus und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation gewinnen und am dritten und sechsten Tag Vorratsproben von etwa zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Röhrchen in FBS mit 10 % DMSO einfrieren. Die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Konischgefäß überführen und die Zellkulturmulde einmal mit einem Milliliter QBSF 60 Stammzellmedium waschen, um die adhärenten Zellen zu sammeln.

Die Zellen durch Zentrifugation gewinnen, das Zellpellet in zwei Milliliter em resuspendieren. Anschließend die Zellsuspension in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte überführen und die Kultur am neunten Tag in den Inkubator zurückbringen. Die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Konischgefäß überführen und die Vertiefung einmal mit einem Milliliter QB SF 60 Stammzellmedium spülen, um die anhaftenden Zellen zu sammeln; die Kultur bei 300 ×g zehn Minuten lang zentrifugieren.

Als Nächstes das Zellpellet in einem Milliliter frischem EM resuspendieren, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Polybrain und STEM-Lentivirus für ein MOI von eins bis 10 enthält. Anschließend die Suspension in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte überführen und 90 Minuten bei 2.250 U/min und 25 Grad Celsius zentrifugieren. Weitere einen Milliliter frisches EM mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Polybrain hinzufügen, sodass insgesamt zwei Milliliter EM vorliegen, und die Platte am Tag 10 in den Zellkulturinkubator stellen.

Nach der Gewinnung der Zellen wie zuvor gezeigt, resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Milliliter EM-Kulturmedium. Die transduzierten Zellen aus einem Wells einer 12-Well-Platte am Tag 11 beschichten die Wells einer 6-Well-Platte mit 0,1 % Gelatine und säen anschließend inaktivierte embryonale Mausfibroblasten in Meth-Medium mit zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Well aus. Bereiten Sie drei Wells pro Infektion vor.

Am nächsten Tag die transduzierten mononukleären Zellen wie zuvor gezeigt gewinnen. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in drei Milliliter Meth-Medium, das BFGF, Ascorbinsäure und Wachstumsfaktoren enthält, resuspendieren.

Entfernen Sie nun das Medium von der MES-Platte, wobei ein Milliliter der MCs pro Vertiefung OFMs verwendet wird. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter komplettes Meth-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 500 U/min und 25 Grad Celsius. Kultivieren Sie danach ab Tag 14 für zwei Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch 2,5 Milliliter Meth-Medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter BFGF und 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure enthält, jedoch keine Wachstumsfaktoren. Ab etwa Tag 20, sobald sich kleine Kolonien bilden, versorgen Sie die Zellen zwischen Tag 30 und Tag 40 täglich mit zwei Millilitern humanem embryonalem Stammzellmedium. Picken Sie jede Kolonie und überführen Sie sie in einzelne Vertiefungen einer 12-Loch-Platte, die zuvor mit inaktivierten Mathes beschichtet wurde und ein Milliliter HESC-Medium plus ROCK-Inhibitor enthält; versorgen Sie die Zellen täglich.

Anschließend werden die aus humanen Monozyten stammenden pluripotenten Stammzellen mit einem Milliliter HESC-Medium ohne Rock-Inhibitor versetzt und sind nun bereit für die Immunfluoreszenz-Färbung von Pluripotenzmarkern sowie für die Entfernung der integrierten Reprogrammierkassette. Während dieses Protokolls durchlaufen die Zellen mehrere morphologische Veränderungen, ausgehend von P-BMCs bis hin zur Generierung humaner iPS-Zellen. Am Tag null werden die isolierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut nach neun Tagen in einem Expandierungsmedium kultiviert.

Traubenartige Ansammlungen, vergleichbar mit Zellhaufen, werden beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Zellen gesund sind und sich vor der Transduktion vermehren. Etwa am 21. Tag nach der Aussaat der Zellen auf MAs bilden sich Kolonien. Am Tag 30 zeigen die iPS-Zellkolonien eine typische, embryonalen menschlichen Stammzellen ähnliche Morphologie.

Diese Immunfluoreszenz-Analyse von aus PBMCs generierten IPCs zeigt die Expression der Pluripotenzmarker SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81. Die iPSCs färben außerdem positiv für alkalische Phosphatase. Diese Bilder zeigen die Schritte zur Generierung transgenfreier IPCs durch Transfektion mit einem Plasmid, das koexprimiert wird und die CRE-Rekombinase sowie ein Puromycin-Resistenzgen enthält, wie von Summers et al. 2010 beschrieben. Im Vergleich zu IPCs vor der Transfektion wird Zelltod beobachtet.

Nach zwei Tagen Puromycin-Selektion entstehen neue Kolonien aus resistenten Zellen etwa 10 Tage nach der Transfektion. Südliche Blot-Analysen an ausgewählten Kolonien bestätigen die Entfernung des Transgens. Die Bahnen 1, 3, 5 und 7 zeigen das Vorhandensein des Transgens in iPS-Zellklonen vor der Entfernung. Diese Bänder fehlen in den Bahnen 2, 4, 6 und 8 nach der Entfernung des Transgens. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, hochwertige, normale oder krankheitsspezifische humane iPS-Zellen konsistent und robust aus geringen Mengen peripheren Blutes eines beliebigen Individuums zu erzeugen.

Dieser Ansatz vereinfacht den Prozess der Rep-Programmierung, um ihn für die Stammzellgemeinschaft weithin zugänglich zu machen. Gleichzeitig bietet er eine Grundlage für die Erzeugung homogenerer Populationen von Stammzelllinien.