Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Hallo, mein Name ist Brad Hamilton. Ich bin Wissenschaftler in der Forschungs- und Entwicklungsabteilung von STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man humane Fibroblasten mithilfe von lentiviral überbrachten Reprogrammierungs-Faktoren umprogrammiert.

Dieses Verfahren kann sowohl zur Erzeugung von iPS-Zellen als auch zur Untersuchung des Reprogrammierungsprozesses verwendet werden. iPS-Zellen ähneln ES-Zellen in ihrer Morphologie, Proliferation und Differenzierungsfähigkeit in alle Gewebetypen des Körpers. Menschliche iPS-Zellen besitzen einen deutlichen Vorteil gegenüber ES-Zellen, da sie wesentliche Eigenschaften von ES-Zellen aufweisen, ohne das ethische Dilemma der Embryodestruktion zur Gewinnung der Zellen.

Die Erzeugung patientenspezifischer iPS-Zellen umgeht ein wichtiges Hindernis für personalisierte Therapien der regenerativen Medizin, indem das Risiko einer Immunabstoßung nicht autologer transplantierten Zellen ausgeschlossen wird. Beginnen wir also. An mehreren Stellen dieses Protokolls ersetzen Sie das Medium der wachsenden iPSCs oder induzierten pluripotenten Stammzellen durch Meth-bedingtes Medium.

Die Herstellung dieses Mediums dauert sechs Tage. Beginnen Sie daher mindestens eine Woche vor Beginn Ihres Experiments. Zum Starten besäen Sie jedes Loch einer Sechs.

Mikrotiterplatte mit zweimal 10 hoch 5 cfu Meth-Fütterungszellen in zwei Milliliter Meth-Wachstumsmedium. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag das Medium auf humane E-S-I-P-S-Zellkultur wechseln.

Das Medium über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Überstandmedium sammeln und alle 24 Stunden über vier Tage hinweg durch frisches Medium ersetzen. Den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter filtrieren.

Versetzen Sie das gesammelte Überstandmedium mit 15 Nanogramm pro Milliliter BFGF (basic fibroblast growth factor). Am Ende erhalten Sie etwa 16 Milliliter meth-bedingtes Medium; lagern Sie den täglich gesammelten Überstand getrennt bei vier Grad SIUs. Meth-bedingtes Medium kann ein bis zwei Wochen bei vier Grad Celsius oder mehrere Monate bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden.

Nun, da Sie sichergestellt haben, dass Ihr mit Meth behandeltes Kulturmedium genau dann bereitsteht, wenn Sie es benötigen, kommen wir zur Vorbereitung der Zellen. Die erste Aufgabe bei der Erzeugung von iPS-Zellen besteht darin, humane Fibroblasten der Vorhaut oder BJ-Zellen mithilfe von Lentiviren mit vier für Stammzellen charakteristischen Transkriptionsfaktoren zu transduzieren. Zum Vorbereiten der Transduktion säen Sie BJ-Zellen mit einer Dichte von einem Mal 10 hoch 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte aus und kultivieren diese.

Die Zellen in zwei Millilitern Wachstumsmedium über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am selben Tag. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Meth-Fütterungsplatten, indem Sie zwei Milliliter 0,1 % Gelatine, verdünnt in Wasser, einer Sechs-Well-Platte hinzufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Die Gelatine beschichtet die Vertiefungen und dient als Matrix für diese.

Jetzt sind die BJ-Zellen bereit für die lentivirale Transduktion, um das Virus für die Transduktion vorzubereiten. Ergänzen Sie zwei Milliliter frisches Medium mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain und vier Lentiviren, von denen jedes einen der menschlichen Transkriptionsfaktoren T four, SO two nanog und lin 28 exprimiert, sodass jedes die gleiche Multiplizität der Infektion oder MOI aufweist.

Diese Lentiviren sind alle im Lentivirus-Set für humane Reprogrammierungsfaktoren enthalten. Um die Transduktion durchzuführen, ersetzen Sie einfach das Wachstumsmedium der BJ-Zellen durch das Virus enthaltende Medium. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, damit das Medium gleichmäßig den Boden bedeckt.

Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am selben Tag. Entnehmen Sie eine Vial mit cf one meth Fütterungszellen aus flüssigem Stickstoff und tauchen Sie sie auf. Entfernen Sie die Gelatinelösung von den meth Fütterungszellplatten, die nun jeweils mit Gelatine beschichtet sind.

Wir geben 0,2 mal 10 hoch fünf Zellen in zwei Milliliter Meth-Zellkulturmedium. Inkubieren Sie die MES über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag lösen Sie die BJ-Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA ab und zentrifugieren sie fünf Minuten bei 200 ×g.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in Wachstumsmedium resuspendiert. Entfernen Sie das Medium von der Meth-Feeder-Platte und geben Sie zwei Milliliter pro Vertiefung der BJ-Zellsuspension hinzu. Die BJ-Zellkonzentration sollte etwa fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung betragen.

Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. 24 Stunden nach dem Zurückziehen der BJ-Zellen auf der Meth-Fütterungsplatte das Medium durch humanes E-S-I-P-S, das embryonale Stammzellen- oder induzierte pluripotente Stammzellkultur-Medium, ersetzen. Wechseln Sie das Medium weiterhin alle 24 Stunden für sieben Tage.

Am siebten Tag ersetzen Sie das ES-Zellkulturmedium durch zwei Milliliter Meth-konditioniertes Medium. Die Meth-Füttererzellen haben die löslichen Faktoren bereitgestellt, die zum Wachsen von iPS-Zellen benötigt werden. Nun müssen jedoch weitere dieser Faktoren zugegeben werden, um die Kultur gesund zu halten.

Das Meth-bedingte Medium enthält alle löslichen Faktoren, die von Meth-Fütterungszellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid sezerniert wurden. Wählen Sie mithilfe des Mikroskops eine Zellkolonie aus. Diese zeichnet sich durch ein kleines, kompaktes, kuppelartiges Aussehen in einer frischen 24-Loch-Platte aus, die Sie zuvor 24 Stunden mit ccf-einer Meth-Fütterungszelle präpariert haben. Isolieren Sie die ausgewählte Kolonie in der humanen E-S-I-P-S-Kultur.

Milieu, ergänzt mit 10 µM Stammzellmolekül Y 2 7 6 3 2, einem abhängigen Kinasemhemmer. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden während der ersten sieben Tage durch Medium ohne Zusatz von Stammzellmolekül Y 2 7 6 3 2.

Nach sieben Tagen Medium wechseln und in Meth. konditioniertes Medium umstellen. Die Zellen weiterhin passagieren, bis sie eine typische Morphologie menschlicher ES-Zellen aufweisen. Achten Sie auf kleine, kompakte, kuppelförmige Kolonien mit scharfen Rändern.

Die Kolonien sollten einheitlich sein und ein hohes Verhältnis von Kern zu Cytoplasma aufweisen. An diesem Punkt haben Sie Kolonien entwickelt, die die Morphologie von ES-Zellen aufweisen, aber exprimieren sie auch Gene, die charakteristisch für ES-Zellen sind? Um dies herauszufinden, färben Sie die Kolonien für Pluripotenzmarker wie TRA 180 1 TRA one 60 SSEA four s, SE, a three T four sox, two nanog und SSEA one. Beginnen Sie damit, die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS zu waschen.

Als Nächstes fixieren Sie die Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd oder einem anderen Fixansmittel für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um überschüssiges Fixansmittel zu entfernen. Danach blockieren Sie unspezifische Bindungen, indem Sie die Zellen pro Vertiefung mit 500 µL Blockierpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Blockierschritt geben Sie 250 µL Primärantikörper, verdünnt im Verhältnis 1:100 in Blockierpuffer, in jede Vertiefung.

Am nächsten Tag die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem Primärantikörper inkubieren. Die Zellen dreimal mit PBS waschen, um nicht gebundenen Primärantikörper zu entfernen. Die Zellen für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 250 Mikroliter Sekundärantikörper, verdünnt im Verhältnis 1:300 in Blockierpuffer, inkubieren, dabei vor Licht schützen, um eine Photobleiche zu vermeiden, nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS bis zum dritten Waschschritt. Geben Sie DPI in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu, um die Kerne anzufärben. Schließlich analysieren Sie die Genexpression Ihrer iPS-Zellen.

Unter dem Mikroskop zeigten die Morphologieergebnisse an menschlichen Hautfibroblastenzellen, die gleichzeitig mit T4, SOX2, Nanog und Lin28 transduziert wurden, morphologische Veränderungen bereits ab dem vierten Tag nach der Transduktion, und die Zellverbände waren am 17. Tag dichter gepackt. Zur weiteren Charakterisierung der isolierten iPS-Zellkolonien suchten wir nach dem Vorhandensein gängiger Pluripotenzmarker, die in ES-Zellen exprimiert werden. Die Kolonien wiesen eine starke alkalische Phosphatase-Aktivität auf.

Zusätzlich wurde an den iPS-Zellkolonien eine Immunchemie beziehungsweise immunzytochemische Färbung (ICC) mit einem Panel pluripotenzspezifischer Antikörper durchgeführt, einschließlich der Oberflächenmarker TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 und SSEA-3 sowie der nukleären Marker Oct4, SOX2 und Nanog. Die isolierten iPS-Kolonien zeigten eine positive Reaktion für alle Marker. Die ICC-Ergebnisse zeigen, dass die iPS-Zellen das entsprechende Expressionsmuster für Pluripotenzmarker aufwiesen, was belegt, dass diese iPS-Zellen undifferenzierten humanen ES-Zellen stark ähneln.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man IPS-Zellen erzeugt, indem man humane Fibroblasten mit dem Stammgen-Lentivirus-Set für Reprogrammierungsfaktoren umprogrammiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere Faktoren zu berücksichtigen.

Zunächst kann das Verhältnis von aktiven Viren zu Zielzellen im primären Transduktionsschritt möglicherweise angepasst werden müssen, um eine optimale Transduktionseffizienz zu erreichen. Zweitens können die Wachstumsbedingungen der Zielzellen einen Einfluss haben. Gesunde und proliferierende Zellen lassen sich leichter umprogrammieren.

Drittens empfiehlt es sich bei der Anpassung des Protokolls an unterschiedliche Zellzahlen, die Zielzellzahlen proportional zur Oberfläche der Kulturschale anzupassen. Letztens sollte die Anwendung von ROCK-Inhibitoren wie Y 2 7 6 3 2 in Betracht gezogen werden, um eine erfolgreiche Umprogrammierung sicherzustellen, da neuere Studien deren Wirksamkeit bei der Verbesserung der Überlebensfähigkeit menschlicher ES-Kolonien belegt haben. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.