Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

In diesem Videoartikel werden humane adulte Fibroblasten mithilfe retroviraler Vektoren zu pluripotenten Stammzellen umprogrammiert. Zunächst werden humane Fibroblasten mit retroviralen Vektoren, die die Transkriptionsfaktoren T three four, SOX two, KLF four und cmic kodieren, transduziert.

Die infizierten Fibroblasten werden 14 bis 28 Tage lang auf embryonalen Maus-Stützzellen kultiviert. Die resultierenden Kulturen werden mit dem TRA 180 1-Antikörper gefärbt, um Kolonien reprogrammierter Zellen zu identifizieren. Positive Kolonien werden anschließend in Platten mit MEF zur Vermehrung übertragen.

Die immunzytochemische Färbung bestätigt die Expression von Pluripotenzmarkern und die Etablierung pluripotenter Stammzelllinien. Anschließend sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um die Linien weiter zu charakterisieren. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der somatischen Zellreprogrammierung und Kultur humaner induzierter pluripotenter Stammzellen sind, Schwierigkeiten, da es schwer ist, die korrekten iPSC-Kolonien zu identifizieren.

Den Versuch wird Dr. Sula Pollak, Post-Doktor O-Stipendiatin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie den Versuch, indem Sie Phoenix-AM-FO-Zellen mit einer Dichte von etwa sieben bis acht Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Platte in 10 Milliliter Hochglukose-DMEM ausplattieren, in den Inkubator stellen und über Nacht kultivieren. Bereiten Sie am nächsten Tag Transfektionsgemische vor, die aus 12 Mikrogramm eines Vektors, der entweder T drei vier SOX, zwei klf, vier cmic oder das GFP-Gen kodiert, sowie 35 Mikroliter Few-Gene-sechs in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern serumfreiem Hochglukose-DMEM mit L-Glutamin bestehen.

Inkubieren Sie die Gemische 20 Minuten lang. Anschließend pipettieren Sie vorsichtig die DNA-Komplexe zur Transfektion in die Platten mit Phoenix-Zellen, die 70 bis 80 % konfluent sein sollten. Inkubieren Sie die Zellen nach sechs bis acht Stunden bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch acht Milliliter High-Glucose-DMEM mit Antibiotika. Danach bringen Sie die Platten für 12 Stunden nach der Inkubation in den Inkubator zurück. Verwenden Sie eine Pipette, um das virushaltige Medium abzusaugen und zu sammeln.

Danach das Medium ersetzen und diesen Vorgang alle 12 Stunden wiederholen, bis das Medium insgesamt viermal gesammelt wurde. Das Medium bei vier Grad Celsius lagern. Sobald das gesamte Medium gesammelt ist, alle Portionen vereinigen und dann durch einen 0,45-Mikrometer-Rohroberseitenfilter in ein 50-Milliliter-Kegelrohr gießen, um abgelöste Zellen und Rückstände zu entfernen.

Das filtrierte Medium, das virale Partikel enthält, kann zwei Wochen lang im Kühlschrank aufbewahrt werden, ohne infektiöse Aktivität zu verlieren. Ein Einfrieren wird nicht empfohlen. Am Tag vor dem Transduktionsverfahren den gefrorenen Bestand an adulten humanen Fibroblasten auftauen und je eine mal zehn hoch fünf Zellen pro jeder Vertiefung von sechs-Vertiefungs-Gelatine-beschichteten Platten hinzufügen.

Am nächsten Tag in einem 50-Milliliter-Konischgefäß jeweils 3,5 Milliliter T4-SOX2-, klf4- und cmic-Virusmedium kombinieren und Polybrain auf eine Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Liter als Kontrolle hinzufügen. Ein Milliliter GFP-Virusmedium, drei Milliliter Kulturmedium und Polybrain auf eine Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter vorbereiten. Das Medium von der Platte mit humanen Fibroblasten abpipettieren.

Dann vier Milliliter gemischtes virales Medium oder Kontrollmedium hinzufügen und die Platten bei 1600 ×g für eine Stunde bei 20 °C zentrifugieren. Anschließend die Platten für etwa 12 Stunden inkubieren. Danach das virale Medium durch Fibroblastenkulturmedium ersetzen und weitere 12 Stunden inkubieren.

Wiederholen Sie diesen Prozess von der Infektion bis zur Kultivierung in Fibroblasten-Medium insgesamt zwei weitere Male nach der letzten Infektion. Kultivieren Sie die Fibroblasten für 48 Stunden in DMEM. Überprüfen Sie anschließend die Effizienz der Infektion der parallelen Transduktionen mit dem GFP-Retrovirus-Medium.

Danach die Reprogrammierung von somatischen zu pluripotenten Zellen einleiten. Die infizierten Fibroblasten werden in humanem embryonalen Stammzellmedium oder HES-Medium kultiviert und mit mausartigen embryonalen Fibroblasten oder MEFs mit einer Dichte von etwa zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Vertiefung einer Gelatine-behandelten Sechs-Vertiefungs-Platte in Fibroblasten-Wachstumsmedium am folgenden Tag beimpft.

Teilen Sie die infizierten humanen Fibroblasten mit 0,05 % Trypsin-EDTA und säen Sie sie mit einer Dichte von etwa 1,2 × 10⁴ pro Vertiefung in Fibroblasten-Wachstumsmedium aus. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch HES-Medium, das 0,5 mmol/l Natriumbutyrat enthält, für die ersten sieben Tage der Reprogrammierung.

Ersetzen Sie das Medium täglich. Wechseln Sie das Medium zu HES-Medium ohne Natriumbutyrat und setzen Sie die Reprogrammierung weitere sieben bis 21 Tage fort. Erneuern Sie das Medium jeden Tag täglich.

Überprüfen Sie die transduzierten Zellen auf morphologische Veränderungen. Kolonien von Zellen beginnen etwa 10 Tage nach der Übertragung der transduzierten Fibroblasten auf Fütterungszellen zu entstehen. Die Kolonien, die die reprogrammierten Zellen enthalten, werden nun als humane induzierte pluripotente Stammzellen oder humane IPS-Zellen bezeichnet.

Die humanen iPS-Zellkolonien sind 14 bis 28 Tage nach der Aussaat auf MEF-Fütterzellen zur Isolierung bereit. Zu diesem Zeitpunkt können humane iPS-Zellkolonien entweder auf Platten mit MEF-haltigem Untergrund oder auf mit Matrigel beschichteten Platten übertragen werden. Die Übertragung auf Platten mit MEF-haltigem Untergrund wird einen Tag vor dem Auswählen der humanen iPS-Zellkolonien demonstriert. Besäen Sie 24-Well-Platten, die mit durch Gamma-Strahlung inaktivierten MEF-Fütterzellen in Fibroblasten-Wachstumsmedium enthalten.

Inkubieren Sie am Tag, an dem die humanen iPS-Zellkolonien ausgesät werden sollen, bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Aspirieren Sie das Fibroblastenwachstumsmedium von den ME-Fs und spülen Sie diese mit PBS, um Reste von FBS zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter humanes embryonales Stammzell- oder HES-Medium, das 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor Y 2 7 6 3 2 enthält, in jede Vertiefung. Untersuchen Sie danach mithilfe eines Mikroskops, das in einer laminaren Flusswerkbank montiert ist, die Reprogrammierungsplatten auf die Bildung humaner iPS-Zellkolonien.

Falls erforderlich, entfernen Sie die Fibroblasten, die die Kolonien humaner iPS-Zellen umgeben, mit einer 21-Gauge-Nadel. Spülen Sie die Platten mit PBS und geben Sie frisches HES-Medium mit dem lebend-spezifischen Antikörper TRA 180 1 dazu. Stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2.

Nach 30 Minuten das Medium durch frisches HES-Medium ergänzt mit 10 Mikromolar Rock-Inhibitor ersetzen. Anschließend die Kolonien unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten. TRA-1-81-positive Kolonien markieren.

Unter Verwendung einer Objektivmarkierung mit einer 21-Gauge-Nadel schneiden Sie die TRA 180 1 positiven humanen iPS-Zellkolonien in mehrere kleine Stücke. Danach übertragen Sie mithilfe einer automatischen Pipette Fragmente der humanen iPS-Zellkolonien in einzelne Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit MEFs. Vermeiden Sie die Übertragung von nicht-iPS-Zellen.

Stellen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie die Kolonien humaner iPS-Zellen 24 bis 36 Stunden lang anheften; wechseln Sie das Medium täglich. Die Kolonien humaner iPS-Zellen mit korrekter, HE-ähnlicher Morphologie sind 48 Stunden nach der ersten Übertragung auf eine 24-Loch-Platte sichtbar; passagieren Sie die Kolonien manuell alle sechs bis acht Tage, indem Sie sie mit einer Nadel der Größe 21 G schneiden. Erweitern Sie die Kulturen nach der klonalen Expansion auf eine 12-Loch-Platte und anschließend auf eine 6-Loch-Platte.

Und nach der Etablierung der humanen iPS-Zelllinien Analyse der Expression von Pluripotenzmarkern TRA 1-60, SSEA-4, T3-4, SOX2 und Nanog mittels Immunchemie, sobald die Zelllinien etabliert wurden. Eine detaillierte Charakterisierung kann in vitro und in vivo erfolgen. Dazu gehören Differenzierungsanalysen, Karyotyp-Analysen, Analyse der Transgen-Silenzierung, Methylierungsstudien und Genexpressionsstudien.

Eine effiziente Transduktion mit Retrovirus enthaltendem Medium ist entscheidend für eine erfolgreiche Umprogrammierung, um die Wirksamkeit der viralen Transduktion zu bestimmen. Menschliche adulte Fibroblasten, isoliert von einem Patienten mit Friedreich-Ataxie, wurden nach zwei aufeinanderfolgenden Infektionen mit GFP-Retrovirus-Medium untersucht. Wenn die Fibroblasten lediglich durch Inkubation mit dem viralen Medium infiziert wurden, waren weniger als 20 % der Zellen transduziert. Hingegen stieg die Effizienz der Transduktion dramatisch an, wenn die Zugabe des GFP-Retrovirus-Mediums unmittelbar gefolgt wurde.

Hier wurden mehr als 80 % der Zellen transduziert, um eine erste Charakterisierung der isolierten humanen iPS-Zellkolonien durchzuführen. Die Expression von Pluripotenzmarkern, die für humane ES-Zellen charakteristisch sind, wurde mittels Immunchemie wie hier gezeigt überprüft. Die isolierten Kolonien humaner iPS-Zellen waren positiv für die Pluripotenzmarker.

T drei vier SOX zwei nano SSEA vier und TRA ein 60 DNA. Doppelmarkierung mit DPI, wie in den oberen Feldern gezeigt, wird sowohl in den menschlichen iPS-Zellkolonien als auch in den Fütterzellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass menschliche iPS-Zellen, die mit diesem Reprogrammierungsprotokoll gewonnen wurden, geeignete Pluripotenzmarker exprimieren, die charakteristisch für undifferenzierte menschliche pluripotente Stammzellen sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche Fibroblasten erfolgreich mithilfe einer retroviralen Transduktion in pluripotente Stammzellen umprogrammiert werden können, wie man die korrekten Kolonien menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen identifiziert und eine erste Charakterisierung der hiPS-Zellen durchführt.